作者简介：戴尽波（1988-），硕士研究生，研究方向为食品安全。
E-mail ：jinbodai@量子点标记免疫技术在食品中小分子有害物检测中的应用戴尽波(广东顺德工业设计研究院(广东顺德创新设计研究院)，广东省佛山市 528311)摘 要：量子点（quantum dots ，QDs ）是一种荧光纳米颗粒，具有荧光量子产率高、发射光谱窄、发射波长可调等优点，是近几年发展起来的一种新型荧光标记物，在食品中小分子有害物免疫检测中的应用已成为研究的热点。
本文总结介绍了三种常用的QDs 与抗体/抗原偶联方法及其各自优缺点，并对基于QDs 的荧光免疫分析方法在食品中小分子有害物检测中的应用进行了详细综述。
关键词：量子点、偶联、食品安全、小分子、荧光免疫分析Applications of Quantum Dots as Probes in Fluorescent Immunoassays of Low MolecularWeight Food ContaminantsDAI Jinbo(1. Guangdong Shunde Industrial Design Institute, Foushan 528311, China)Abstract ：Quantum dots (QDs) are semiconductor nanoparticles with very interesting optical properties, like high quantum yield, narrow and size-tuneable fluorescence spectra. The application of QDs are wide-spread, particularly as fluorescence labels in food safety recently received increased attention. In this review, three methods of coupling antibody/antigen to QDs are discussed. And the development of QD-based fluorescent immunoassays for the detection of low molecular weight compounds of analytes in food safety areas is also demonstrated.Key words ：Quantum dots, Conjugation, Food safety, Low molecular weight compounds, Fluorescent immunoassays 中图分类号：TS201.6食品中小分子有害物质是引起食源性疾病的主要因素，如果蔬中的有机磷、氨基甲酸酯类等农药残留，动物性食品中的磺胺类、喹诺酮类等兽药残留，谷物中的黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮毒素等真菌毒素，还有一些人为非法添加的如三聚氰胺、苏丹红等有害物，对这些物质建立快速、准确的检测方法成为当今食品安全中的研究热点。
标记免疫分析方法因具有快速灵敏、成本低廉、适宜现场检测等优点，被广泛应用于食品中小分子有害物质的快速检测中。
目前常用的标记免疫分析技术有酶免疫分析（Enmayme imrrmnoassay ，EIA ）、胶体金免疫分析（Gold immunochromatography assay ，GICA ）、发光免疫分析（Luminescence imrrmnoassay ，LIA ）和荧光免疫分析（Fluorescenc imrrmnoassay ，FIA ），对应的标记物分别是酶、胶体金、化学或生物发光体系、荧光物质。
在这些标记物中，酶自身不稳定，容易失活，灵敏度较低；胶体金虽然稳定性好，检测结果易观察，但灵敏度低，无法进行定量检测；化学和生物发光分析法的灵敏度虽然很高，但发光时间短，易受外部环境影响，结果重现性较差；荧光探针虽然克服了以上不足，但传统的有机荧光染料中存在着激发光谱窄、荧光稳定性差的缺点，难以对分析物进行高通量的检测[1,2]。
量子点( Quantum Dots，QDs) 是一种半导体荧光纳米材料，具有优良的光谱特征和光化学稳定性。
与传统荧光染料相比，其激发光谱宽、发射光谱窄、斯托克斯位移大、发光效率高、发光寿命长、发光颜色可调、光稳定性好，十分适合作为荧光标记物，基于QDs建立的标记免疫分析方法具有灵敏度高、稳定性好，可用于高通量检测的优点，被广泛应用于食品安全快速检测领域[3,4]。
本文就常用的量子点抗体/抗原偶联方法、QDs标记荧光免疫技术在食品小分子有害物质检测方面的应用研究做了综述。
1量子点与生物分子偶联方法量子点标记免疫技术将QDs作为荧光标记物，首先需要将QDs与抗体或抗原进行偶联，制备荧光探针用于分析检测。
目前，QDs与抗体或抗原偶联的常用方法有活泼酯法、马来酰亚胺法、生物素-亲和素间接连接法。
1.1 活泼脂法活泼酯法主要是用于羧基QDs与抗体/抗原的氨基连接。
常用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）为交联剂，由于EDC与羧基反应的中间产物不稳定，活化时还需加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺( NHS)，活化后的羧基和抗体/抗原表面的氨基形成酰胺键，生成共价结合的偶联物（图1a）[5]。
该方法优点是大部分抗体或抗原都含有氨基和羧基，与QDs偶联之前不需要进行化学修饰，且偶联过程中不需特殊试剂、成本低、只需一步反应。
但该方法也存在以下缺点：（1）EDC的最佳反应pH 为酸性，而带羧基QDs需在碱性条件下才能保持较高的溶解度和较好的稳定性；（2）反应的不定向性，即在与抗体的反应过程中，QDs可能会与抗体的结合位点连接，造成非特异性封闭，降低抗体的亲和性；（3）生物分子之间容易发生交联反应，发生聚沉。
如抗体与抗体之间容易发生交联，产生沉淀，所以实验过程中QDs与抗体的比例应该严格控制，以减少抗体之间的交联反应[6-8]。
1.2 马来酰亚胺法马来酰胺亚法主要是通过抗体片段的巯基（-SH）与QDs表面的氨基进行连接。
首先要利用二硫苏糖醇（DTT）的还原性，将抗体上两条重链之间的二硫键还原，断裂生成巯基（-SH）。
为了保证断裂生成的抗体片段仍然具有抗原结合能力，还原过程中需要精确控制DTT的添加量，保证只有抗体两条重链之间的二硫键发生还原断裂，而轻链与重链之间的二硫键不发生还原断裂。
经过还原生成的抗体片段（一条重链加一条轻链，分子量为75KD）有两个巯基基团能与QDs的氨基进行偶联，用琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯（大约0.83nm长）作为交联剂进行连接。
偶联时QDs上的氨基先与交联剂的琥珀酰亚胺酯基反应，然后抗体片段上的-SH与交联剂的马来酰亚胺基团反应，最终量子点与抗体片段之间通过SMCC连接形成偶联物（图1b）[9,10]。
该方法的最大优点是抗体与QDs偶联具有方向性，即QDs只与抗体重链上的-SH反应，不会占据抗体上的抗原结合位点，但在与QDs偶联之前，需要用还原剂对抗体进行分解，容易造成重链与轻链之间的二硫键断裂，抗体活性损失大，与QDs标记后活性较低。
1.3 生物素桥间接偶联生物素-亲和素系统非共价连接法主要是利用生物素和亲和素之间的高度亲和力将QDs与生物分子连接（图1c）。
该方法主要通过QDs修饰亲和素或生物素来实现：（1）QDs修饰亲和素，生物分子修饰生物素，首先通过静电吸附或共价交联的方法将亲和素修饰到QDs表面，然后再与修饰了生物素的生物分子混合反应，生物素-亲和素非共价结合将量子点与抗体连接。
（2）QDs修饰生物素，生物分子修饰亲和素，带氨基功能基团的QDs在交联剂作用下与生物素羧基共价连接，或者先将生物素与聚合物共价偶联，然后再将聚合物修饰到QDs表面。
然后将生物素化的QDs与亲和素修饰的生物分子混合反应连接。
（3）将QDs和生物分子同时修饰生物素，然后将两者混合后加入亲和素进行连接[11-15]。
生物素-亲和素优点是结合物比较稳定，能够放大反应信号；缺点是试剂价格昂贵，操作复杂，此外由于蛋白上的生物素或亲和素连接的位置不能严格控制，生物素可能接近于抗体的抗原识别区，导致抗体亲和力降低。
图1 不同的量子点-抗体/抗原生物偶联方法Fig1. Schematic diagrams showing various methods for QD-antibody bioconjugation图1中a活泼酯法b马来酰亚胺法c生物素亲和素法2 量子点标记免疫技术在食品中小分子有害物质检测应用量子点标记免疫技术是基于免疫反应对待测物进行检测的一项食品检测新技术，是一种超微量测定技术，已成为食品安全检测的重要工具之一。
食品安全快速检测中常用的量子点标记免疫分析方法有荧光酶联免疫分析法（Fluorescence-linked immunosorbent assays, FLISA）、量子点荧光免疫层析法（Immunochromatographic assay）。
2.1量子点荧光吸附免疫分析法（FLISA）酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是在小分子免疫检测中使用最广泛的一类免疫分析方法，其原理是先将酶标记在抗体或抗原上，然后将标记物进行免疫反应，洗涤后加入酶底物，检测酶催化底物产生的信号，信号的强度与被检测物质浓度成比例关系。
同样的可以将QDs作为荧光材料与抗原或抗体偶联，建立荧光免疫分析方法（FLISA），建立的方法不仅灵敏度更高，而且操作更简便，不需要添加底物反应显色。
Chen等[16]以QDs标记的羊抗鼠二抗为检测信号，建立了检测鸡肉中的恩诺沙星残留的间接竞争荧光免疫分析方法（indirect competitive fluorescence-linked immunosorbent assay ，icFLISA），该方法的线性检测范围为1~100 ng/mL，检测限（limit of detection，LOD）达到2.5 ng/mL。
Chen等[17]同样的利用QDs标记的羊抗鼠二抗，建立快速检测饮用水中毒死蜱的icFLISA，该方法LOD为8.4 ng/mL，与传统酶联免疫分析法（ELISA）相比，不仅灵敏度提高1.5倍，检测时间也缩短0.5h；Sun等[18]分别用生物素、链霉亲和素标记羊抗兔二抗、QDs，利用生物素-亲和素放大系统，建立检测水中17 β-雌二醇的icFLISA，该方法的检测线性范围0.01-10,000 ng/mL ，LOD达到0.00542 ng/mL。