β-葡聚糖酶活力测定方法

• 1 原理

• β-葡聚糖酶(EC.3.2.1.6)水解1，3（4）-β-D-葡聚糖苷键，放出还原糖基团与3，5-二硝基水杨酸(DNS试剂)发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖的含量成正比关系，在540nm测其光的吸收值，查标准曲线（以葡萄糖计），可得到还原糖的量，据此计算β-葡聚糖酶的活力。

• 2 仪器和设备

• 2.1 分析天平：精度0.0001g

• 2.2 恒温水浴：精度±0.2℃

• 2.3 计时表

• 2.4 分光光度计

• 2.5 沸水浴器

• 2.6 振荡混合器

• 2.7 pH计: 精度0.01pH单位

• 3 试剂和溶液

• 3.1 0.1M乙酸－乙酸钠缓冲溶液（pH5.0）

• 溶液A:量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1M醋酸溶液。

• 溶液B:称取8.2g醋酸钠，溶解定容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。

• 使用时以A:B =3:7的比例混合，低温冷藏备用。

• 3.2 1%的β—葡聚糖溶液的配制

• 准确称取0.25gβ—葡聚糖放入100ml锥形瓶中，加2ml无水乙醇摇匀到无可见颗粒。加20ml无离子水混合15分钟，盖紧塞子在沸水中煮5分钟，放置室温自然冷却，或用自来水流水降温。将已冷却到室温的底物溶液倾入一只25ml容量瓶中，加入2.5ml1M醋酸缓冲液（pH5.0），并用无离子水定容到25ml。

• 3.3 3,5—二硝基水杨酸（DNS）溶液

• 溶液A:称分析纯的NaOH 104g溶于1300ml水中,加入30g分析纯3,5－二硝基水杨酸。

• 溶液B:称分析纯酒石酸钾钠910g，溶于2500ml水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钠加入酒石酸钾钠溶液。

• 将A、B溶液混合，加入1200ml水，定容5000ml，贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后过滤使用。

• 3.4 0.1%苯甲酸

• 0.1g苯甲酸加入大约80ml无离子水中溶解，用无离子水定容至100ml。

• 3.5 标准葡萄糖溶液的配制

• 无水葡萄糖80℃烘干至恒重，准确称取100mg溶于100ml水中，加1mg叠氮化钠防腐。4℃冷藏备用。

• 4 分析步骤

• 4.1 标准曲线的绘制

• a) 取7支带有15ml刻度的试管，按下表取试剂 •

•

试管号 0 1 2 3 4 5 6

取标准葡萄糖溶液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

蒸馏水（ml） 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8

葡萄糖的实际含量（mg/ml） 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

DNS显色剂（ml） 2 2 2 2 2 2 2

沸水浴 10min

定容（ml） 15ml

OD540

• b) 测得OD值与葡萄糖毫克数在计算机上或人工拟合曲线，求得Y=ax+b一元线性方程中间的a和b值。要求所绘曲线相关系数r≥0.999。

• 4.2 样品测定

• 4.2.1 酶样制备

• 准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样，用pH5.0醋酸缓冲液溶解并定容至100ml，则该酶已经稀释100倍。

• 4.2.2 酶样测定

• a) 对于每一个被测酶样品，取1ml底物溶液置于四支试管(1ml/管),三支供测试酶活性，一支作空白,50±0.2℃保温2-3分钟.

• b) 加1ml酶稀释液向三个测试管中，空白管中加1ml无离子水代替酶稀释液。

• c) 四支试管均于50℃反应10分钟。

• d) 取出后每管加2mlDNS试剂,具塞,沸水煮5分钟。

• e) 冷却后，加10ml无离子水，充分混匀。

• f) 用空白管调零，于540nm测OD，

• 4.2.3 计算

• 将测得的各平行样求OD值的均值， 计算酶的活性单位依据以下公式

• β—葡聚糖酶的活力= U/g(ml)

•

• 式中 x:为样品OD 值的平均值

• b和a由葡萄糖浓度和相应的OD值通过回归方程求的

• n:酶粉（液）的稀释倍数

• 10:酶促反应的时间

• F:底物校正因子（1.047）通常由底物提供厂家标明

• W:酶样品的重量（1g或1ml）