新疆农业大学
科学技术学院
本科生专业文献综述
题 目: 植物基因转化的方法研究
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专 业: 生物技术
班 级: 生技092
学 号: *********
座位号 : 06
****: ***
2012 年 5 月 15 日
新疆农业大学科学技术学院制
植物基因转化的方法研究
作者：杨洪
摘要:转基因植物的研究主要在于改进植物的品质，改变生长周期或花期等提高其经济价值或观赏价值；作为某些蛋白质和次生代谢产物的生物反应器，进行大规模生产；研究基因在植物个体发育中，以及正常生理代谢过程中的功能。
关键词:植物全能性；转基因；基因转化
前言:转基因植物的研究最早始于20世纪八十年代，1983年全球第一例转基因烟草在美国问世，1996年美国最早开始商业化生产和销售的转基因作物，包括大豆、玉米、油菜、土豆和西红柿。
转基因作物的问世是为了解决我们实际的问题的，抗旱、抗盐碱作物为了增加耕地面积，抗虫抗病作物为了减少化肥农药的使用量，改良品质的转基因育种为了改善人民的生活，高能生物燃料为了解决未来的能源危机，世界范围内都在广泛重视并应用的转基因技术，我们只有掌握并充分利用他，才能在国际社会中立于不败之理。
正文:
1转基因植物
1.1 概念
转基因植物的研究主要在于改进植物的品质，改变生长周期或花期等提高其经济价值或观赏价值；作为某些蛋白质和次生代谢产物的生物反应器，进行大规模生产；研究基因在植物个体发育中，以及正常生理代谢过程中的功能。[1]
1.2 优点
以植物作为生物技术的实验材料有其特定的优点，那就是植物细胞大部分都有全能性(totipotency)，可以用单个细胞分化发育出整个植株。这样，经过基因工程改造的单个植物细胞有可能再生成一棵完整的转基因植株。这些植
株还可通过有性生殖过程把改变了的性状遗传给下一代。[2]
1.3 转化受体
植物基因工程用作外源基因的转化受体有许多种，包括胚性愈伤组织(cai—lus)、分生细胞、幼胚、成熟胚、受精胚珠、种子和原生质体等。从这些受体细胞都可获得再生的转基植株。[3]
2以外植体为受体的基因转化方法
2.1 农杆菌介导法
农杆菌介导法是最早应用、最实用有效并且具有最多成功实例的一种植物转基因方法[ 4]农杆菌是一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌[ 5]。目前, 用于植物转基因介导的农杆菌是根癌农杆菌和发根农杆菌。某些根癌农杆菌和发根农杆菌分别含有大小为200—800bp的结构和功能相似的Ti质粒和Ri质粒。Ti质粒和Ri质粒含有3个功能区:参与农杆菌侵染植物过程的vir区、参与农杆菌基因整合到宿主植物基因组过程的T-DNA区、在农杆菌中启动质粒复制的ori区。在vir区上的vir操纵子群作用下, Ti质粒和Ri质粒能将自身的T-DNA转入宿主植物细胞内, 而后将T-DNA整合到植物基因组中。T-DNA是质粒上一段10—30kb的序列, 它的两端各有一段高度保守的25bp的同向重叠序列。由于T-DNA转化无序列特异性,因此可用任何基因片段代替原来的T-DNA基因片段进行。
2.1.1 农杆菌介导法的原理
在农杆菌基因chvA, chvB,pscA, andatt家族所编码的蛋白和植物口产生的酚类物质和糖类物质的共同作用下, 农杆菌识别并附着在宿主细胞壁上。virD4和virB基因编码蛋白组成的type IV分泌系统将单链VirD2-T-DNA复合体运送到宿主细胞内。此外, VirE3、VirE2和VirF蛋白也通过该系统进入宿主细胞质中。在宿主细胞质中, VirE2蛋白与VirD2-T-DNA复合体结合。在VirD2核定位信号、某些农杆菌蛋白和宿主细胞蛋白的共同作用下,
VirD2-T-DNA复合体进入细胞核。在VirD2、VirE2、某些宿主细胞核蛋白如AtKu80和DNA连接酶的作用下, T-DNA被整合到宿主基因组中,但具体过程不详。
2.1.2农杆菌介导法的基本步骤
1.诱导目标植物外植体;2.构建含有目的基因的质粒;3.质粒导入合适的农杆菌菌株中及该菌株的活化过程;4.植物愈伤组织的微伤口处理及农杆菌侵
染; 5.共培养及脱菌处理;6.愈伤组织筛选、分化与植株再生;7.再生植株及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测;8.转基因T1代的目标性状鉴定[6]。
2.1.3 农杆菌介导法的优点与缺点
具有操作简单、转化效率较高、重复性好、单拷贝整合、基因沉默现象少、转育周期短、转化片段较大且插入片段明显及实验费用低等优点, 因此,
农杆菌介导法是目前应用最广泛的一种植物转基因方法[ 7]。但是, 农杆菌介导法也存在一些问题。首先,在自然条件下,农杆菌只侵染双子叶植物。对于单子叶植物,虽然可以采用人工添加酚类物质的方法,诱导农杆菌完成侵染过程,但是单子叶植物的组织培养有一定的难度。目前,只发现20多种单子叶植物能被农杆菌侵染。其次, 植物细胞壁对农杆菌介导转化效果有一定影响。再次,影响农杆菌转化效率的因素较多。在设计农杆菌介导实验时,研究者要考虑农杆菌菌株类型、质粒载体类型及两者间的匹配情况; 外植体的基因型、来源和发育状态;培养基成分及某些诱导条件如是否加入酚类物质等。此外,植物愈伤组织的诱导过程有时会存在困难。
2.2基因枪法
基因枪是20世纪80年代初由园艺学家Sanford等人发明的。在此基础上,
Klein等以基因枪为工具发展了一套物理学转基因方法。经过10多年的改进和提高, 基因枪的发展经历了3个阶段: 第一代基因枪是1987年由Sanford等设计制造的火药基因枪, 它是以火药爆炸的冲力为动力; 第二代基因枪是高压放电基因枪, 它是以高压放电引起水滴汽化所产生的冲力为动力;第三代基因枪是压缩气体驱动基因枪,它是以高压惰性气体为动力。由于存在明显的安全性和稳定性问题,前两代基因枪现已基本被淘汰。作为一种物理学方法,
基因枪技术已成功应用在烟草、水稻、小麦、甘蔗、棉花、大豆、洋葱、番木瓜和葡萄等许多农作物的品种改良上,并且该技术被用于瞬间表达研究和培育稳定的转基因植株等研究领域。
2.2.1 基因枪法的原理
利用基因枪产生的高压动力冲击波将包裹外源DNA的重金属颗粒(如钨粉、金粉等)射穿植物细胞壁和细胞膜,射入植物细胞, 使外源DNA随机整合到植物细胞染色体中, 达到使外源DNA在受体植物中正常表达和稳定遗传的目的[ 8]。
2.2.2 基因枪法的基本步骤
1.诱导目标植物外植体;2.构建含有目的基因的质粒或制备外源DNA样品;3.重金属颗粒的外源基因包被过程;4.植物愈伤组织的前处理;5.基因枪轰
击过程;6.愈伤组织筛选、分化与植株再生;7.再生植株及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测。
2.2.3 基因枪法的优点与缺点
操作方法简单,转化时间短、数量大, 对受体植物几乎无要求,基因用量少, 可转化基因片段大, 可获得较长时间的瞬时表达, 实验费用低等优点。然而基因枪法也有许多缺点。首先,由于基因枪法转导的外源DNA是随机整合到宿主基因组中的, 这不利于外源DNA在宿主植物中稳定地表达和遗传。其次,因为随机整合位点不固定和外源DNA拷贝数多等问题会导致转基因后代的突变率提高、整合的外源DNA丢失及基因沉默等现象。此外, 基因枪法还存在转化过程对细胞有损害、转化率低、嵌合体多、可重复性差及设备昂贵等缺点[9]。
2.3超声波介导法
作为一种新创建的物理学基因转化方法, 超声波介导法已被用于真核生物的基因转化研究和人类基因治疗领域。在农作物基因转化研究中, 超声波介导法已成功地将外源DNA转导入烟草和甜菜的原生质体、玉米和小麦的未成熟胚及烟草的叶片中。目前, 该方法常与农杆菌介导法共用以提高外源DNA的转化效率[ 10]。
2.3.1 超声波介导法的原理
利用超声波的空化作用, 在细胞膜上产生可恢复的渗透孔空洞, 从而使外源DNA进入细胞。
2.3.2 超声波介导法的基本步骤
1.目标植物外植体的制备;2.目的基因的制备;3.超声波处理;4.转化受体俞伤组织的筛选与植株再生;5.再生植株及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测。
2.3.3 超声波介导法的优点与缺点
不受宿主范围的限制,可以将外源基因导入任何基因型的植物细胞内;
该方法可以避免对细胞的机械性损伤, 有利于原生质体的存活;该方法操作简便、设备便宜等优点。由于超声波介导法也存在外源DNA随机整合及外源DNA拷贝数多等问题。因此,该方法也会导致转基因后代的突变率提高、整合的DNA丢失及基因沉默等现象。
3以种质系统为受体的基因转化方法
3.1 子房注射法
子房注射法是一种育种工作中经常使用的简便易行的植物转基因方法。1993年, 丁群星及其同事首次使用子房注射法将Bt基因导入玉米子粒中并成功获得了具有一定玉米螟抗性的转基因玉米[ 11]。目前, 子房注射法成功用于玉米、小麦、甜瓜和黄瓜等农作物的转基因育种工作中。
3.1.1子房注射法的原理
使用微注射针或显微注射仪将外源DNA注入处于减数分裂期的受体植物的子房中, 借助子房产生的压力和卵细胞产生的吸收力, 外源DNA进入受精的卵细胞中,借助合子胚旺盛分裂过程中基因组的复制、重组、缺失或易位等现象, 外源DNA被随机整合到受体染色体上。
3.1.2 子房注射法的基本步骤
1.目的基因的制备;2.根据受体植物受精后其子房的变化特点, 确定最佳时间,进行外源DNA注射或将离体的受精子房进行外源DNA注射,再对该离体子房进行培养;3.转化种子及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测。
3.1.3 子房注射法的优点与缺点
该方法无需组织培养过程,因此实验过程简单,操作便捷;该方法所用的仪器设备简单便宜;外源DNA直接注射进入子房可以提高转化率[12];该方法可以直接得到转化种子,因此缩短了育种周期。其缺点是:田间转化过程的工作量大;转化过程中,子房受到机械性伤害易导致转化率和结实率低; 易产生杂基因污染;该方法只能在授粉期进行, 受季节和天气等自然条件影响; 由于后代群体规模较大, 筛选过程工作量较大。
3.2 花粉管通道法
20世纪70年代末期, 在DNA片段杂交假设理论和对植物开花受精过程的解剖学及细胞学特征研究的基础上,周光宇等推测外源DNA可以通过花粉管经过的珠心通道进入受精胚囊, 转化进入精卵融合细胞、早期合子及早期胚细胞。随后, 周光宇等创建花粉管通道技术并通过该技术将外源DNA导入陆地棉,
成功地培育出抗枯萎病的新品种。目前,花粉管通道法已成功应用于棉花、水稻、小麦、大豆等农作物的改良和育种工作。