第11卷第2期2013年3月生物加工过程ChineseJournalofBioprocessEngineeringVol．11No．2Mar．2013
doi：10．3969/j．issn．1672－3678．2013．02．003
收稿日期：2012－12－18基金项目：国家高技术研究发展计划（863计划）（2012AA021201）；国家重大科学仪器设备开发专项项目（2012YQ150087）作者简介：王永红（1966—），女，湖南省桂阳人，教授，研究方向：生物过程工程；张嗣良（联系人），教授，E-mail：siliangz@ecust．edu．cn
生物反应器及其研究技术进展王永红，夏建业，唐寅，杭海峰，易小萍，潘江，许建和，张嗣良（华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海200237）
摘要：阐述了生物反应器设计、放大的新理念及关键技术发展，并在此基础上综述了应用于生物技术产品生产的生物反应器的主要发展趋势，包括以代谢流分析为核心的生物反应器系统、基于计算流体力学模拟技术的传统发酵罐改良、微型生物反应器、动物细胞反应器和酶反应器。关键词：生物反应器；计算流体力学；微型生物反应器；动物细胞反应器；酶反应器中图分类号：TQ051文献标志码：A文章编号：1672－3678（2013）02－0014－10
RecentadvancesinbioreactoranditsengineeringWANGYonghong，XIAJianye，TANGYin，HANGHaifeng，YIXiaoping，PANJiang，XUJianhe，ZHANGSiliang
（StateKeyLaboratoryofBioreactorEngineering，EastChinaUniversityofScienceandTechnology，Shanghai200237，China）
Abstract：Theengineeringmethodologiesandkeytechnologiesforthebioreactordesignandthescale-upwerediscussed．Thedevelopmenttrendsinbioreactorsfortheproductionofbiotechnologyproductsweredescribed，includingabioreactorsystemfocusingonmetabolicfluxdetectionandanalysis，theimprovedstirred-tankbioreactorbasedoncomputationalfluiddynamics，microbioreactor，bioreactorformammaliancell，andenzymaticbioreactor．Keywords：bioreactors；computationalfluiddynamics；microbioreactors；bioreactormammaliancell；enzymaticbioreactors
1生物技术产业发展与生物反应器
随着全球社会经济快速发展，现有石油煤炭等化石资源的充分供应变得不可持续，难以支撑人类社会的高级发展目标。人类社会发展将从依赖于化石燃料等碳氢化合物资源转变为依靠淀粉、纤维素、多糖、植物和微生物油脂等可利用太阳能持续合成的碳水化合物资源。这种能源和资源结构的转变将为生物技术及其产业发展带来极大机遇和挑战。借助于各种生物系统可利用碳水化合物来规模生产现代社会所需的化学品和能源。这些生物系统包括酶、微生物、动物细胞、植物细胞和动植物组织。而生物系统进行物质转化的生化反应是在生物反应器这个相对封闭的小生境中进行的。生物反应器为生物系统的生化反应提供了可控的环境条件以促使生物过程高效进行，例如，温度、pH、溶氧、混合、剪切、补料等。另外，生物反应器系统供氧与混合效率、操作稳定性和可靠性与生物制造过程节能降耗密切相关，对生物产品生产成本产生很大影响。因而生物反应器设计、放大和操作优化技术及其产业化生产在生物产业发展中起着重要作用。传统反应器一般包括悬浮培养系统反应器和固定化培养系统反应器。前者主要包括搅拌式反应器、气升式反应器；后者主要包括膜反应器、填充床反应器。随着全球对生物技术包括生物基产品需求的快速增长和生物技术相关学科发展，生物反应器出现了一些新的发展趋势，主要表现为高通量、微型化生物反应器应用于生物过程工艺快速开发和优化；工业规模生物反应器朝着大型化、自动化方向发展，并且计算流体力学技术被应用于反应器设计与放大，增强了对于生物反应器供氧、混合与剪切性能的可预期性；对于生物加工过程高密度高产率要求，使得包含新型空气分布系统与搅拌系统有机组合的生物反应器得到了广泛的应用，极大地提高了能源使用效率；多种先进传感技术被运用于生物过程的在线测定，提高了对于生物过程生理代谢状态认识的准确性和即时性；而针对具体培养对象的特殊性，出现了一些专门反应器，如光生物反应器、动物细胞一次性反应器、酶反应器等，这些新型生物反应器也正逐步实现工业规模应用。另外，不同于一般化学或物理过程，生物反应过程涉及基因、蛋白、代谢以及细胞与环境相互作用相关的关系，因而很难用普适公式来总结描述其过程并为生物加工过程相关工程及反应器设计提供理论依据。继续研究生物反应过程基本规律及其新的表征方法是生物反应器工程及其应用获得根本重大进展的基础。在目前阶段，发展生物加工过程新型传感技术、研究可对生物过程进行表征的状态参数群并确定影响工艺优化及反应器放大的敏感参数，已被证明是针对生物加工过程的一种行之有效的工程学方法［1］。笔者在关注生物反应器设计、放大和检测、控制等关键技术的同时，着重阐述应用于生物技术产品生产的生物反应器的主要发展趋势。2以代谢流分析为核心的生物反应器系统2．1系统设计原理及构成生物过程是生物系统在生物反应器中进行生化反应的过程。生物反应器中生物系统及其所处环境构成了相对封闭的生态系统。在这一生态系统中，生物系统与环境因子间存在相互作用。生物系统，特别是以细胞为主体的生物系统，其表型不仅与基因型密切相关，也与细胞所处的微观或宏观环境条件（营养种类、pH、温度、溶解氧、生物反应器的混合与传递特性等）密切相关，也就是说基因型与环境共同决定了生物系统的表型特征。另一方面，生物过程具有高度非线性和时变性特征，难以用环境操作参数的检测与控制为目的的宏观动力学来表征其复杂的本体特征。既然以环境操作参数的检测与控制为目的的宏观动力学研究并不能真正代表生物细胞体复杂的本体特征，因而所开展的过程优化就可能成为无本之木、无水之源。有研究者提出应该结合发酵过程中参数相关的代谢特性，系统地分析细胞的代谢变化，强调细胞的生理状态与参数相关是生物反应器中物料、能量或信息传递、转换以及平衡作用的结果。随着系统生物学和合成生物学研究的深入，也有人提出环境组学研究，Klumpp等［2］开展“垂直研究”（verticalapproach）来补充组学（omics）“水平研究”（horizontalapproach）的不足。因此，尽管其微观影
响因素也许只是发生在基因、酶、细胞或反应器水平的某一个尺度上，但最终会在宏观过程中有所反映，这为研究生物反应器中不同尺度的数据关联分析方法提供了线索。因此，张嗣良等［3］提出了生物反应器生物过程的多尺度问题，认为以细胞为主体的细胞大规模培养的生物反应过程呈现出基因分子尺度、细胞尺度与生物反应器尺度的网络结构，且不同尺度的网络间有着输入输出关系，存在着信息流、物质流与能量流，不同尺度的参数相关关系更能反映生物过程的本质特征，找到影响细胞代谢流的敏感参数是生物过程控制和优化的关键。而理想的生物反应器系统应该要尽可能对于不同尺度操作参数和状态参数进行检测和分析，从而有可能构建一种优化的外在环境，使微生物的基因表达及代谢调控最有利于某种目的产物的生物合成，最大限度地积累目的产物。以上表明了生物过程的工程科学问题，即由宏观动力学研究发展到基于生物过程信息处理的多尺度理论方法研究，由此来指导以生物反应器为核心的生物过程相关工程技术发展。基于上述观点，科技部国家生化工程技术研究中心（上海）设计了一种以代谢流分析为核心的生物反应器系统，已由上海国强生化工程装备有限公
51第2期王永红等：生物反应器及其研究技术进展司组织生产。该生物反应器系统包括各种用于细胞生理代谢特性检测的先进传感器、用于生物过程微观代谢流分析的传感反应器及控制系统、适用于细胞生理代谢参数相关分析的计算机软件包和用于发酵过程数据处理及远程分析的计算机互联网系统等。该系统能够尽可能多地获得生物加工过程各尺度的生物信息，然后基于多尺度参数相关原理，通过计算机软件的实时数据处理，在海量数据中找到以参数相关性特征为依据的过程优化关键参数，进而用来指导工艺操作、设备设计或菌种筛选改造，最终实现过程优化与放大。该系统先后成功地应用于青霉素、红霉素、鸟苷、金霉素、链霉素、黄霉素、泰乐霉素、克拉维酸、基因工程白蛋白、基因工程疟疾疫苗、基因工程可利霉素、重组植酸酶、头孢菌素C、辅酶Q和维生素B12等多种产品的生产过程优化，大幅提高了发酵单位的能力，其优化工艺一般可由几十升发酵罐直接放大到上百立方米的工业生产发酵罐。2．2先进在线仪表开发和应用以代谢流分析为核心的生物反应器系统配备了先进的传感系统。除了具有pH、温度、搅拌转速、溶氧、转子流量计等常规检测控制参数外，还根据精确测定生物过程氧消耗速率（OUR）和CO2释放速率（CER）的需要配置了热质量流量计（进行进气流量的精确测定和控制，保证其不受进气压力的影响）、发酵液称量系统、尾气氧和CO2测量仪（尾气成分测定仪或过程尾气质谱分析仪）、置顶式硅油压力传感器。还可根据需要配置微观代谢流分析传感反应器及控制系统、原位活细胞浓度在线测定仪、细胞形态在线显微观测仪等在线传感器。根据测定得到的直接参数，通过用于细胞生理代谢参数相关分析的计算机软件包，可以计算得到CER、OUR和RQ等重要生理代谢状态参数。过程尾气质谱分析仪主要用于尾气中O2、CO2和N2浓度测定。该质谱仪采用电子轰击离子源，来源于不同发酵罐的尾气经过在线预处理后，通过多通路旋转阀不断地输入电离室形成离子，利用带电粒子在电场中的运动规律，四极杆质量分析器将离子源产生的离子按其质荷比（质量和电荷的比，m/z）进行分离，测定离子质量强度分布，得到化合物种类及其浓度信息，准确反映发酵尾气成分变化。测量结果可被输入到针对发酵过程设计的专用软件包，实现与其他发酵参数的相关分析。尾气质谱仪对相对分子质量300以内的挥发性气体成分都可以进行测定，因此还可根据发酵需要对乙醇、甲醇等小分子物质进行检测。该仪器目前已由上海舜宇恒平科学仪器有限公司实现国产化。生物量是发酵过程重要参数。目前通常通过一些经典测定方法，如干质量、浊度等，进行离线测定而得到。原位活细胞浓度在线测定仪不但可以进行即时的在线测定，而且获得的是生物学意义更为丰富的活细胞浓度。这对于那些培养基中含有不溶固体物质的发酵过程尤为合适。活细胞测定仪原理是基于0.1～10MHz频率范围的交变电场中，发酵液中细胞表面如细胞膜会发生非导电极化，使得有完整原生质膜的活细胞基本上像一个电容器（一般脂质原生质膜的非传导性本质使得电荷增长），而死细胞、裂解细胞、细胞碎片、气泡和其他基质组分基本上不可极化。利用双电极施加上述频率范围交变电场，双电极之间的电容测量值依赖于细胞类型和细胞大小，并在一定范围内与活菌浓度成正比。原位活细胞浓度在线测定仪适用范围包括各种动植物细胞、酵母、细菌及藻类等。但对于那些需用酸碱作为目的产物中和剂的发酵过程不合适，因为发酵液中过大的离子强度会干扰电容的准确测定。