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大豆脂肪氧合酶的提取工艺
脂肪氧合酶对食品质量的影响有利与弊两个方面。脂肪氧合酶是食品原料 中固
有的一种酶，它的作用对食品质量的影响既有助于提高某些质量指标如颜 色、质构、
风味等，又可能对某些质量指标如营养成分含量、食品颜色等有不 利影响。
脂肪氧合酶属氧化还原酶。脂肪氧合酶中含有非血红素铁，专一催化具有 顺，
顺 -1，4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸，通过对其分子加氧，形成过氧化 氢衍生
物。脂肪氧合酶广泛存在于植物界中，特别是从人类大量食用的大豆中 提取的脂肪氧
合酶活性高于其它植物来源。大豆中蛋白含量为 40%左右，脂肪
氧合酶是大豆中活性最高的酶。
许多研究结果认为脂肪氧合酶在植物生理，如植物萌发、生长、发育、衰 老、
抗性等物质转化中起某种重要调节作用，会影响植物脂肪在萌发期的氧 化，脂肪过氧
化形成乙烯影响植物叶片衰老，脂肪氧化影响种子的衰老、死 亡、果蔬催熟和脱落，
可以运用于植物抗病、抗虫和伤害反应中。
一、试验目的
了解大豆脂肪氧合酶的提取工艺
了解哪个工艺对脂肪氧合酶酶活影响最小
二、试验原理
以低温脱脂大豆粉为原料，采用水浸提、二次盐析、聚乙二醇 （PEG共沉淀
等方法提取脂肪氧合酶，并对 LOX活性进行测定和比较，以便综合评价提取方 法的
优劣。同时研究了影响脂肪氧合酶活性的因素和化学微环境影响，为保存 和合理利用
LOX提供理论基础。
三、试验材料
原料：大豆；
试剂： Tween 20（化学纯）；亚油酸；其它化学试剂或溶剂均为分析纯。
设备：752型紫外光栅分光光度计，PHS-3B精密pH计，LD4-2型离心机，
81-2 型恒温磁力搅拌器。
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四、试验方法
1. 脂肪氧合酶的提取
大豆经粉碎后再经石油醚多次浸提得到脱脂大豆粉。每批次 10 g脱脂大豆
粉为原料 ,
料液比为 1 ： 10(质量：体积 )，按下述 5 方法提取脂肪氧合酶：
(A) 水浸提法：加水搅拌50 min, 4 000 r/ min条件下离心20 min,上清液即 为
粗酶液。
(B) 酸提-盐析法：加水并用1 mol/ L盐酸调pH值至4. 5,搅拌50min，过 滤；
滤液中加入固体硫酸铵至 40 %饱和，离心分离20 min，弃去残渣；上清液 中加入固
体硫酸铵至60 %饱和，离心分离20 min，沉淀用pH值9. 0的0. 2 mol/ L 的硼酸盐
缓冲液溶解得到酶液。
(C缓冲液提-盐析法：加pH值4.5的乙酸-乙酸盐缓冲液，搅拌50 min，其余
步骤同 (B)。
(D) 碱溶-酸提-盐析法:加水并用1mol/L氢氧化钠调pH值至9.0，搅拌
30min，离心20min，弃去沉淀；上清液用1mol/L盐酸调pH值至4.5，继续搅 拌，
其余步骤同 (B)。
(E) 聚乙二醇共沉淀法：加水并用 1mol/L盐酸调pH值至4.5，搅拌50min， 过
滤；滤液中加入50%的 PEG-6000至 PEG浓度达30%，继续搅拌40min，离心 分
离20min，用pH值9.0的0.2 mol/ L的硼酸盐缓冲液溶解沉淀，滤去不溶物 得到酶
液。
2. 酶活测定
25C、pH值9.0下，以亚油酸为底物的3 mL反应体系在234 nm处每分钟 增加
0.001吸光度值定义为一个酶活单位。将 0. 25 mL Tween 20分散于 10 mL pH值
9.0的0.2 mol/L的硼酸盐缓冲液中，摇动下逐滴加入 0.27 mL亚油酸，充 分混合，
加入 1 mol/ L 氢氧化钠溶液使体系澄清，调 pH 值至 9. 0 ,然后用上述缓 冲液稀释
到500 mL作为底物。取0. 2mL酶液(已稀释一定倍数)移入1.5mL的底 物溶液中，
混匀后于25C水浴中恒温3min,用5mL无水乙醇终止反应，然后加 入5mL蒸馏
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水，混匀后测定反应液在 234nm处的吸光度。空白样为0. 2 mL酶 液中加5 mL无
水乙醇，再加1.5 mL底物溶液，于25C恒温3 min,然后加入5 mL蒸馏水。
五、试验结果与分析
结果记录：
提取方法
(A) 水浸提
(B) 酸提-盐析物态总酶活酶比活/(Ug-1)或-1
(UmL) (C缓冲液提-盐
析
(D) 碱溶-酸提-盐
析
(E) PEG共 沉淀
分析：
盐析法是比较古老的方案,但目前仍广泛采用,它根据酶和杂蛋白在高浓 度盐溶
液中的溶解度差别进行分离纯化。最常用的盐是硫酸铵。二次盐析法是 用较低盐浓度
除去杂蛋白,再用较高盐浓度进行分离纯化。盐析法的优点是简 便、安全、重现性好,
缺点是分辨率低、纯度提高不显著。共沉淀法利用离子 型表面活性剂如十二烷基硫酸
钠、非离子型聚合物如 PEG等，在一定条件下能
与蛋白质直接或间接地形成络合物。使蛋白质沉淀析出；然后再用适当方法使 需要的
酶溶解出来，除去杂蛋白和沉淀剂，从而达到纯化目的。 PEG无毒、溶
解时散热低、形成沉淀的平衡时间短，一般当 PEG的浓度达到30%时，就可以
使大部分蛋白质沉淀出来