ＹＹ超雄黄颡鱼和全雄黄颡鱼规模化繁育刘汉勤１，一，管波１，徐江２，侯昌春２田华１，陈宏溪２’１．水利部中国科学院水工程生态研究所，湖北武汉４３００７９；２．武汉百瑞生物技术有限公司，湖北武汉４３００７９
摘要：本研究利用激素性逆转技术、雌核发育技术和测交验证技术，筛选到ＹＹ超雄黄颡鱼和雌性ＹＹ超雄黄颡鱼，实现了ＹＹ超雄黄颡鱼和全雄黄颡鱼规模化生产。利用ＸＹ生理雌性黄颡鱼进行人工雌核发育，同时取部分雌核发育后代用ｌ７Ｄ．雌二醇进行性逆转；然后进行测交验证筛选出ＹＹ超雄黄颡鱼及ＹＹ生理雌鱼；再将ＹＹ生理雌鱼与ＹＹ超雄鱼交配批量获得ＹＹ超雄黄颡鱼，同时实施雌激素性逆转批量获得ＹＹ生理雌鱼；将批量的ＹＹ超雄黄颡鱼和ＹＹ生理雌鱼交配，实现ＹＹ超雄黄颡鱼规模化繁育，将规模化生产的ＹＹ超雄鱼与普通ＸＸ雌鱼交配实现全雄鱼规模化生产。２００８．２０１０年累计生产ＹＹ超雄黄颡鱼达到１２．３万尾，累计生产全雄黄颡鱼达到８１００万尾，苗种雄性率为１００％。因此，本研究证实ＹＹ超雄黄颡鱼及其生理雌鱼均能存活而且是可育的，且利用ＹＹ超雄黄颡鱼技术进行单性育种是稳定可靠的，Ｙ超雄育种技术具有较大的应用前景。
１．１．前言黄颡鱼（Ｐｅｌｔｅｏｂａｇｒｕ￥』ｕｌｖｉｄｒｏｃｏＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ），属鲶形目，鳞科，黄颡鱼属．因其肉质细嫩、肉味鲜美、无肌间细刺而颇受消费者欢迎，２００８年中国黄颡鱼养殖产量达到１３４４４８吨，２００９年中国黄颡鱼养殖产量达到１６３５５６吨，年增幅达２１．６ｓ％黄颡鱼已经成为中国重要的淡水养殖品种【Ｉｊ．根据我们的调查，在相同养殖条件下，雄性黄颡鱼比同胞雌鱼的生长速度在当年快３０％－５０％，二龄黄颡鱼雄性比雌性的生长快１－２倍．因此，如能采用鱼类性别控制技术，在生产上推广全雄性黄颡鱼养殖，可大幅度提高渔产品的质量、产量与效益，具有重大的现实经济意义．为此，刘汉勤等（２００７）利用鱼类激素性逆转技术获得）（Ｙ生理雌鱼，然后通过）（Ｙ生理雌鱼雌核发育产生了ＹＹ超雄鱼，ＹＹ超雄鱼与普通）（）（雌性黄颡鱼交配获得了雄性率为１００％全雄黄颡鱼‘２１．大量的研究人员对ＹＹ基因型超雄鱼及其生理雌鱼的生存力和繁殖力存在一定的争议，关于’ｒＹ超雄鱼及其生理雌鱼是否存活和可育的问题一直以来研究人员比较关注．Ｙａｍａｍｏｔｏ（１９５５）通过激素性逆转和选育技术首次在青鳝（Ｏｒｙｚｉａｓｌａｔｉｖｅｓ）｛＝ｉＥ实ｗ超雄鱼存在【射．随后通过激素性逆转、雌核发育、雄核发育和选育技术获得ＹＹ超雄鱼，如虹辅（Ｐｏｅｃｉｌｉａｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）１４】，金鱼《ｃａｒ口ｓｓ觚ｏｕｒｏｔｕ￥如ｃ）【５ｌ，斑点叉尾鲴（『ｃ幻ｆｕ，ｕｓｐｕｎｃｔａｔｕｓ）旧，罗非鱼
（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓｎｉｌｏ“ｃｕｓ）阮８，９１乘］（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ．ｍｏｓｓａｍｂｉｃｕｓ）ｔ１０１，虹鳟鱼（５ａ『ｍｏｇａｉｒｄｎｅｒｉ）［１１ｉ鱼里鱼＿＿（Ｃｙｐｒｉｎｕｓｃａｒｐｉｏ
Ｌ．）‘１２１，玫瑰鲫鱼（Ｐｕ删协ｃｏｎｃｈｏｎｉｕｓ）‘１３１，证实Ｗ超雄鱼能够存活且可
育．也有’，Ｙ超雄鱼不能存活的报道，如暹罗色＿（Ｂｅｔｔａｓｐｌｅｎｄｅｎｓ）‘１４１，玫瑰鲷（Ｃｉｃｈｌａｓｏｍａ
ｎｉｇｒｏｆａｓｃｉａｔｕｍ）Ⅱ习．
科学家希望利用激素性逆转技术将Ｙｙ超雄鱼雌性化，获得ＹＹ生理雌鱼，然后将ＹＹ生理雌鱼与’ｒＹ超雄鱼交配可实现ＹＹ超雄鱼规模化繁育，这样批量生产得到的ＹＹ超雄鱼与普通ｘ×雌鱼交配可实现全雄鱼规模化生产，因此，利用ＹＹ超雄鱼雌性化是实现ＹＹ超雄鱼规模化繁育关键的一步，也是制约全雄鱼模化生产的关键点扭１６１．关于利用雌性激素性逆转ｗ超雄鱼产生ｗ生理雌鱼也有少量的报道，可能一个最主要的原因为ＹＹ生理雌鱼不能存活或者不育．如ＹＹ虹鲥生理雌剑１７ｌ和ＹＹ的斑点叉尾鲴【１８ｌ等．Ｄａｖｉｓ等（１９９５）报道了基因型为ＹＹ的斑点叉尾鲴雌鱼和雄鱼交配仅仅能产生１％的能够存活的卵，其中主要的原因为Ｙｙ生理雌鱼存在严重的生殖问题【１剐，随后虽然有ｗ超雄斑点叉尾鲴的报道，但是没有关于Ｙｙ斑点叉尾鲴雌鱼的报道【堍２０】．ＶｅｒａＣｒｕｚｅｔａ１．，（１９９６）报道外源雌性激素己烯雌酚（Ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ，ＤＥＳ））性逆转ｗ基因型罗非鱼，转性率低于６４％ｆ１６】，而普通ＸＹ雄鱼转性率高于９０％，认为利用雌激素进行人工性别逆转过程中ＹＹ幼鱼雌性化比正常雄鱼要困难，可能与正常雄鱼比较ｗ幼鱼在性分化过程中分泌高水平的睾丸酮相关慨堋．
虽然我们已经获得ｗ超雄黄颡鱼，但是如何实现ＹＹ超雄黄颡鱼雌性化以及Ｙｙ生理雌鱼是否能存活和可育有待进一步研究，是制约ＹＹ超雄黄颡鱼和全雄黄颡鱼模化生产的关键点。本文重点研究如何筛选稳定可靠的ＹＹ超雄黄颡鱼繁育家系和ｗ超雄黄颡鱼和全雄黄颡鱼规模化繁育．
１．２．材料与方法１．２．１．ＹＹ超雄黄颡鱼和全雄黄颗鱼规模化繁育技术路线介绍２ｗ超雄黄颡鱼繁育系的建立技术路线如下（图１）：第一步，利用ＹＹ超雄黄颡鱼与普通雌鱼交配获得）（Ｙ全雄黄颡鱼；第二步。将全雄黄颡鱼用１７Ｂ．雌二醇进行性逆转获得）（Ｙ生理雌性黄颡鱼；第三步，利用）（Ｙ生理雌性黄颡鱼进行人工雌核发育，同时取部分雌核发育后代用１７Ｂ．雌二醇进行性逆转，另一部分单独饲养：第四步，进行候选、，Ｙ超雄黄颡鱼及Ｙｙ生理雌鱼的测交验证（见图２），每个家系分别同时实施３种交配方法，从测交后代雌雄鱼性比推断该侯选雄鱼的基因型，筛选３种交配方法后代均为１００％雄鱼的家系；第五步，ＹＹ超雄黄颡鱼与ＹＹ生理雌鱼交配．实现超雄黄颡鱼批量繁殖；同时用１７１３．雌二醇进行性逆转批量繁殖的ｗ超雄黄颡鱼，获得批量的ＹＹ生理雌鱼；第六步，ｗ超雄黄颡鱼与普通）（Ｙ雌鱼交配，实现超雄黄颡鱼规模化繁殖．圆×圆
』Ｓｔｅｐｌ圆
ＪＥ：眙ｘ删ｅｎａｌｓｔｅｐ２
阿田Ｉ．．．．．．．．．．．．．．．．．．＿Ｊ
回亍回
网Ｉ．．．．．．．．．．．．．．．ＪＳｔｅｐ
３
Ｓｔｅｐ４Ｓｔｅｐ５
Ｓｔｅｐ６
３Ｉ正常雄鱼Ｉｌ（杏ｘⅥＩ
：＝．：二：二：：二：：：＝：：ｆ广…一。一…一—。ｆＩ方法２ｌ方法３
图２ＹＹ超雄黄颡鱼及’ｒＹ生理雌鱼的测交验证示意图１．２．２．ＹＹ超雄黄颡鱼及ＹＹ生理雌鱼的测交验证、筛选及繁育系建立
２００５年６月，参照图１方法获得全雄黄颡鱼，鱼苗在开口后第Ｓ天，采用浓度为２００Ｉｌｇ／Ｌ的ｚ７１３－雌二醇（Ｅ２）浸泡的卤虫（Ｂｒ．ｎｅＳｈｒｉｍｐ，也称丰年虫）投喂，持续３０天，每天投喂三次，８：００、１３：００和１８：００各一次，饱食投喂（量以半小时内吃完为准），将全雄鱼用进行性逆转获得）（Ｙ生理雌鱼．
２００６年６月，选用长吻觥（ＬｅｉｏｃａｓｓｉｓＩｏｎｇｉｒｏｓｔｒｉｓＧＯｎｔｈｅｒ）遗传灭活精子激活）（Ｙ生理黄颡雌鱼鱼卵．采用冷休克处理方法阻断减数分裂第二极体的排出，恢复成雌核二倍体，黄颡鱼人工雌核发育具体方法见刘汉勤等（２００７）【２１．同时取部分雌核发育后代用１７１３．雌二醇进行性逆转，另一部分正常饲养．
２００７年６月１日．７月１日期间．取性成熟的人工雌核发育后代及其雌激素性逆转的后代实施的测交验证，交配方法见图２，测交获得的后代按不同家系单独饲养，约３个月后即可取出一部分幼鱼，解剖后观察性腺，鉴定精巢或卵巢，记录不同家系测交后代雌雄鱼性别的比例，从测交后代雌雄鱼性比推断该侯选雄鱼的基因型，筛选３种交配方法后代均为１００％雄鱼的家系．
１．２．３．ＹＹ超雄黄颡鱼的小批量雌性化２００８年６月１日－７月１日期间，利用经测交验证后筛选到ＹＹ超雄黄颡鱼及其生理雌鱼交配获得ｗ超雄黄颡鱼鱼苗，鱼苗在开口后第５天，采用浓度为２００ｐｇ／Ｌ的１７１３一雌二醇（Ｅ２）浸泡的卤虫（ＢｒｉｎｅＳｈｒｉｍｐ，也称丰年虫）投喂，每天投喂三次，８：００、１３：００、１８：００４各一次，饱食投喂（以半小时内吃完为准），持续３０天，将ＹＹ超雄黄颡鱼幼鱼进行性逆转获得ｗ生理雌鱼．
１．２．４．ＹＹ超雄黄颡鱼和全雄黄颡鱼规模化繁育一般规模化繁殖黄颡鱼均采用全人工方法，即人工催产、人工受精、人工孵化．人工挑选经强化培育发育较好的雌鱼与雄鱼，催产剂采用鱼用绒毛膜促性腺激素ＨＣＧ２０００ＩＵ＋ＬＨＲＨ—Ａ２０ｕｇ＋鲤鱼垂体１ｍｇ／ｋｇ雌性亲鱼，雄鱼减半注射．将注射过催产剂的黄颡鱼亲
本放入池中，到达效应时间后，用剪刀剖开雄鱼腹部，取出精巢，剪碎加入Ｈａｎｋｓ液或鱼用生理盐水稀释保存，在剪碎精巢的同时将顺产的雌鱼卵挤入瓷盆中，然后精卵混合均匀，加入经曝气的自来水激活授精，最后将卵均匀洒在鱼巢上，放在池子中进行孵化．１尾催产发育好的雄鱼精巢液平均可配５～７尾雌鱼的卵．人工授精完成后，鱼苗孵化和管理为常规方法．产后雌性亲鱼放回专池培育．来年可再繁殖．
黄颡鱼雄性率检测是评估规模化生产过程中全雄黄颡鱼苗种质量的重要方面，黄颡鱼雄性率检测有２种方法：１）利用特异的性别连锁分子标记进行ＰＣＲ检测．适合日龄大子３天的鱼苗刚ｊ２）性腺解剖性别鉴定，适用于日龄大于３０天幼鱼【２】．
１．２．５．数据处理与分析侯选的”ＹＹ”黄颡鱼雌鱼与正常雄鱼）（Ｙ后代测交的性比。理论上后代雌雄性比为０：Ｎ（Ｎ表示测交后代总数），经过卡方检验，０．９５＜Ｐ值＜１．００，即出现理论上后代雌雄性Ｉ：ｔ（ｏ：Ｎ）概率在９５％．１００％之间，侯选亲本可确认为”ＹＹ”黄颡鱼雌鱼．同样，侯选的”ＹＹ”超雄黄颡鱼与正常）ｏ（雌鱼后代测交的性比，理论上后代雌雄性比为０－Ｎ（Ｎ表示测交后代总数），经过卡方检验，０．９５＜Ｐ值＜１．００，即出现理论上后代雌雄性比（０－Ｎ）概率在９５％－１００％之间，侯选亲本可确认为“ｗ”黄颡鱼雄鱼。
１．３．结果１．３．１．ＹＹ超雄黄颓鱼及其生理雌鱼的测交验证、筛选及繁育系建立）（ｙ生理雌鱼雌核发育后代实施１７１３一雌二醇性逆转后获得雌鱼包括ｗ生理雌鱼和）。（雌鱼，对其中３３尾侯选雌鱼成功实施了与正常）（Ｙ雄鱼进行测交，依据后代性比通过卡方检验，共鉴定出’ｒＹ生理雌鱼５尾（表１１．对３０尾）（Ｙ生理雌鱼雌核发育后代雄鱼成功实施了与
Ｓ