图2 Caf对TNF-A诱导BMECICAM-1荧光强度的影响(n=3)**P<0101;TNF-A##P<0101达,从而起到协同致炎作用。本研究考察了Caf是否能抑制TNF-A诱导的炎症因子ICAM-1表达。参考文献[7]并初步筛选,采用25ng/mLTNF-A刺激内皮细胞,炎症因子表达可维持较高水平,此方法可用于后期实验。灯盏细辛主要含黄酮类、咖啡酸酯类、酚酸类以及其他类化合物[8],其主要活性成分之一的黄酮类具有一定扩张血管、增加动脉血流量、保护内皮细胞及抗氧化作用,但对于另一类主要活性成分咖啡酸酯类物质的药理学研究却较少。本研究中笔者首先观察了Caf是否能够抑制TNF-A诱导内皮细胞ICAM-1mRNA的表达水平。结果显示,单独使用TNF-A刺激内皮细胞12h,ICAM-1mRNA表达显著增加,25Lg/mLCaf与TNF-A共同作用内皮细胞12h后,ICAM-1mRNA表达明显降低。其次,笔者观察了Caf对TNF-A诱导内皮细胞膜表面ICAM-1蛋白表达的影响。ICAM-1
收稿日期:2009-02-23基金项目:上海中药现代化重点项目(03DZ19511)作者简介:刘梅(1978-),女,安徽芜湖人,硕士研究生,研究方向:防治脊柱退行性疾病的药效物质基础研究及新药开发。
在正常脑血管内皮细胞呈较低水平表达,TNF-A刺激后可明显升高,这与HanJM等[9]的研究结果基本一致。Caf和TNF-A共同作用的内皮细胞ICAM-1荧光强度明显降低,表明Caf抑制了TNF-A诱导的炎症蛋白分子表达。这些结果提示Caf对BMEC炎性相关因子具有一定调节作用,可能是其治疗脑缺血炎症的机理之一。参考文献[1] 刘宏,杨祥良,徐辉碧.灯盏花的研究进展[J].中草药,2002,33(6):566-568.[2] 张晓莉,刘四海,周芳.灯盏花的药理活性研究[J].四川生理科学杂志,2008,30(2):75-77.[3] CalabriaAR,WeidenfellerC,JonesAR,eta.lPuromycin-purifiedratbrainmicrovascularendothelialcellculturesexhibitimprovedbarrierpropertiesinresponsetoglucocorticoidinduction[J].JNeurochem,2006,97(4):922-933.[4] 张丽慧,魏尔清.ICAM-1、VCAM-1在脑缺血损伤炎症机制中的作用及调控[J].中国药理学通报,2005,21(11):1281-1285.[5] Radomska-LescniewskaDM,SadowskaAM,VanOverveldFJ,eta.lIn-fluenceofN-acetylcysteineonICAM-1expressionandIL-8releasefromendothelialandepithelialcells[J].JPhysiolPharmaco,l2006,57:325-334.[6] KimYS,AhnY,HongMH,eta.lCurcuminattenuatesinflammatoryresponsesofTNF-alpha-stimulatedhumanendothelialcells[J].JCar-diovascPharmaco,l2007,50(1):41-49.[7] HughesCC,MaleDK,LantosPL.Adhesionoflymphocytestocerebralmicrovascularcells:effectsofinterferon-gamma,tumournecrosisfactorandinterleukin-1[J].Immunology,1988,64(4):677-681.[8] 吕曙华,解军波,吕归宝.灯盏细辛的研究进展[J].天津药学,2003,15(2):46-48.[9] HanJM,LeeWS,KimJR,eta.lEffectsofdiarylheptanoidsonthetumornecrosisfactor-alpha-inducedexpressionofadhesionmoleculesinhumanumbilicalveinendothelialcells[J].JAgricFoodChem,2007,55(23):9457-9464.
益气化瘀补肾方纯化工艺研究刘 梅1,张 宁1,王拥军2,施 杞2,唐占英2,叶福媛1(11上海中医药大学,上海201203;21上海中医药大学脊柱病研究所,上海200032)
摘 要:目的:确定益气化瘀补肾方的最佳纯化工艺。方法:以黄芪甲苷含量、淫羊藿苷含量、小鼠耳廓肿胀率、小鼠热板疼痛抑制率为指标,通过药化学和药效学的综合评价,优选最佳纯化工艺。结果:最佳纯化方法为水提醇沉法,加入乙醇使含醇量达70%。结论:最佳纯化工艺合理、可行。关键词:益气化瘀补肾方;纯化;药化学;药效学中图分类号:R28316 文献标识码:A 文章编号:1000-1719(2009)09-1556-03
StudyonPurificationTechnologyofYiqiHuayuBushenRecipe
LIUMei1,ZHANGNing1,WANGYong-jun2,SHIQi2,TANGZhan-ying2,YEFu-yuan1(11ShanghaiUniversityofTCM,Shanghai201203,China;21InstituteofSpinalDiseaseofShanghaiUniversityofTCM,Shanghai200032,China)
Abstract:Objective:ToestablishthebestpurificationtechnologyofYiqiHuayuBushenRecipeMethods:Optimizethebestpurificationtechnologythroughthecomprehensiveevaluationofphysicochemicalandpharmaceuticalcomposition.Results:Thetar-
#1556# 辽宁中医杂志2009年第36卷第9期 getsisAstragalosideÔcontentIcariincontentmouseauricletumefactiondegreeandmousepaininhibitiondegree.Conclusion:thebestpurificationtechnologyisreasonableandfeasible.Keywords:yiqihuayubushenrecipe;purification;physicochemicalandpharmaceuticalcomposition
益气化瘀补肾方为治疗腰椎间盘突出症的中药复方制剂,由黄芪、淫羊藿、川芎等中药组成,具有益气补肾,化瘀通络、消炎止痛的作用。现代药理实验研究证明该复方制剂能增加椎间盘局部微循环,增加椎间盘营养供应,降低退变椎间盘中PGE2等炎症介质和局部免疫反应,降低胶原酶、中性蛋白多糖酶的活性;可以促进雪旺细胞的再生,加快神经肌肉接合部运动终板的重建,提高与乙酰胆碱受体接合速度,缩短神经再生与修复时间,充分证明该复方制剂不仅具有治疗腰椎间盘突出症的功能,而且具有减缓椎间盘退变、预防复发的作用[1-8]。课题组对方中黄芪等药味进行水提,考虑到传统的水提工艺会将药物中很多高分子物质提取出来,可造成成品混浊、病患服用量较大以及损伤胃黏膜等现象,因此拟采用水提醇沉法或壳聚糖澄清法对水提工艺得到的提取液进行纯化,以黄芪甲苷、淫羊藿苷含量、药效指标为考察因素,综合评价不同纯化方法对该工艺的影响,以确定最佳纯化方法。1 纯化方法比较(化学指标)根据文献及实验研究,选择了3种醇沉浓度(50%、60%、70%)、2种壳聚糖含量(0101%、0105%、011%、012%)和直接离心法做比较,以黄芪甲苷含量为指标,确定最佳纯化方法。111 材料与仪器黄芪、淫羊藿:购自上海市养和堂药业有限公司;壳聚糖:药集团化学试剂有限公司;黄芪甲苷标准品、淫羊藿苷标准品:含量测定用,由中国药品生物制品检定所提供;Agilent1100色谱工作站;高速离心机:上海锐仪生物仪器有限公司。112 方法与结果11211 样品制备 精密称取8组药材,按最佳水提工艺进行提取,提取液浓缩至与药材比1B1,第一组加入乙醇使含醇量达50%;第二组加入乙醇使含醇量达60%;第三组加入乙醇使含醇量达70%;第四组加入配置好的0101%的壳聚糖溶液;第五组不做处理;第六组加入0105%的壳聚糖溶液;第七组加入011%的壳聚糖溶液;第八组加入012%的壳聚糖溶液,以上八组样品充分搅匀后静置,冷藏过夜。置高速离心机中离心(3000r/min,15min),取上清液,定容。精密移取适量按黄芪甲苷、淫羊藿苷测定所需的样品处理方法进行处理,供含量测定。11212 指标成分的含量测定 (1)黄芪甲苷的含量测定条件:色谱柱:ThermoHypersi-lKeystone(250mm@416mm,5Lm);流动相:乙腈B水=33B67;流速:1mL/min;蒸发光散射检测器检测,蒸发温度100e,汽化温度80e,气体流速115L/min。(2)淫羊藿苷的含量测定条件:色谱柱:Agilentzorbaxsb-c18(416mm@250mm,5Lm);流动相:乙腈B水=32B68;流速:1mL/min;检测波长:270nm。11213 测定结果 见表1。表1 各纯化组指标成分含量组别得膏率(%)黄芪甲苷含量(mg/g)淫羊藿苷含量(mg/g)50%醇沉组9.680.215.4760%醇沉组11.460.227.7370%醇沉组12.720.39.29直接离心组16.590.38.10.01%壳聚糖组16.610.246.490.05%壳聚糖组16.940.286.520.1%壳聚糖组16.710.206.920.2%壳聚糖组15.470.256.61 检测结果表明,若以黄芪甲苷计,则纯化后黄芪甲苷保留率由大到小分别为直接离心组>70%醇沉>0105%壳聚糖>012%壳聚糖>0101%壳聚糖>60%醇沉>50%醇沉>011%壳聚糖;若以淫羊藿苷计,则纯化后淫阳藿苷保留率由大到小分别为70%醇沉>直接离心组>60%醇沉>011%壳聚糖>012%壳聚糖>0105%壳聚糖>0101%壳聚糖>50%醇沉。2 纯化方法比较(药效指标)该复方制剂治疗腰椎间盘突出症的治则为益气补肾,化瘀通络、消炎止痛。根据其治则本试验选择小鼠耳廓肿胀率和小鼠热板疼痛抑制率2个指标为药效学筛选指标。211 动物用药的制备称取药材,按最佳水提工艺进行提取,分别进行纯化处理,得8组供试品。取芬必得1粒,加水60mL溶解,得芬必得供试品。212 抗炎止痛实验(小鼠热板及耳廓肿胀实验)21211 实验动物与分组 来源:昆明种雌性小鼠,由上海中医药大学动物中心提供,上海医学实验动物管理委员会颁发的医学实验动物合格证书。体重:(20?2)g;动物数:每组小鼠10只。随机分为:对照组、芬必得组、直接离心组、70%醇沉组、0105%壳聚糖组、011%壳聚糖组、012%壳聚糖组、0101%壳聚糖组、60%醇沉组、50%醇沉组。21212 给药剂量 每10g体重给药011mL,给药3天,末次给药1h后进行药效实验。21213 测试仪器 GJ-8402型热板测定仪,中国宁海白石电子医药仪器厂;YSD-4型多用仪的电子秒表;9mm直径打孔器。21214 统计软件 应用SPSS1110软件。21215 小鼠耳廓肿胀法 乙醚麻醉下,将混合致炎液涂在小鼠左耳前后两面,约涂1%二甲苯011mL,右耳作对照。致炎后015h将小鼠断颈处死,沿耳廓基线剪下两耳,用9mm直径打孔器分别在同一部位打下圆耳片,天平称重。计算各组肿胀率。