新疆农业大学学报２０１０，３３（１）：４７～５２　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　

文章编号：１００７—８６１４（２０１０）０１—００４７—０６　

犬细小病毒ＶＰ２基因的克隆表达与免疫印迹分析　

陈胜男，马素贞，陶玉成，申卫红，刘腾飞，简子健　

（新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐８３００５２）　

摘要：　根据基因库已发表犬细小病毒序列设计合成了ＶＰ２基因的１对特异引物，以细小病毒感染的犬粪样品　中提取的总ＤＮＡ为模板，进行ＰＣＲ扩增。把扩增产物克隆至ｐＭＤ１８一Ｔ载体进行测序、鉴定。将克隆的ＶＰ２基　因片段克隆至原核表达载体ｐＧＥＸ一４Ｔ一２，再将构建成功的原核表达质粒载体ｐＧＥＸ一４Ｔ一２一ＶＰ２转化至大肠杆菌　ＢＬ２１（ＤＥ３）中。进行鉴定、测序、表达。结果表明，克隆的ＶＰ２基因片段全长１　７５５　ｂｐ，与１３个ＶＰ２基因序列的同　源性为９８．４％～９９．８　。系统进化树分析表明，所克隆的ＶＰ２　ＣＳＮ８３０６ｌ１序列同日本株（ＡＢ０５４２２２）、意大利株　（ＡＦ３０６４４５）的进化途径一致。Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析显示，表达产物为９０　ｋＤ的融合蛋白，可被犬细小病毒阳性血　清所识别，具有良好的反应原性。　

关键词：犬细小病毒；ＶＰ２基因；克隆；原核表达；反应原性　中图分类号：￥８５１．６５９．２　文献标识码：Ａ　

Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｎｉｎｅ　Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ　ＶＰ２　

Ｇｅｎｅ　ａｎｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｎ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｂｌｏｔ　

ＣＨＥＮ　Ｓｈｅｎｇ—ｎａｎ，ＭＡ　Ｓｕ—ｚｈｅｎ，ＴＡＯ　Ｙｕ—ｃｈｅｎｇ，　

ＳＨＥＮ　Ｗｅｉ—ｈｏｎｇ，ＬＩＵ　Ｔｅｎｇ—ｆｅｉ，ＪＩＡＮ　Ｚｉ—ｊｉａｎ　

（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｕｒｕｍｑｉ　８３００５２，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：　Ｏｎｅ　ｐａｉｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉａｌ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｔＯ　ｃｏｍｐｏｓｅ　ｔｈｅ　ＶＰ２　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｃａ—　

ｎｉｎｅ　ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ（ＣＰＶ）ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｉｎ　ＧｅｎＢａｎｋ．Ｔｈｅ　ＶＰ２　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｉｎ　ＣＰＶ　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　

ＰＣＲ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｉ１ｌ　ｄｏｇ’Ｓ　ｓｔｏＯｌ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＣＰＶ　ａｎｄ　ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ａ　

ｐＭＤ１　８－Ｔ　ｖｅｃｔｏｒ　ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ｐＭＤ１８一ＣＰＶ　ＶＰ２　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｐｌａｓｍｉｄ　ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　

ｔｈｅ　Ｅ．ｃｏｉｌ　ＤＨ５ａ　ａｆｔｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅ　Ｃｌｏｎｅｄ　ＣＰＶ　ＶＰ２　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃ—　

ｔｏｒ　ｐＧＥＸ一４Ｔ一２　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔａｎｔ　ｃｏｎｓｔｒａｃｔ　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｅ．ｃｏｉｌ　ＢＬ２１（ＤＥ３）ｃｅｌｌｓ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｉｄｅｎ—　

ｔｉｆｙｉｎｇ　ａｎｄ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＩＰＴＧ　ｆｏｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｗａｓ　ｓｈｏｗｎ　ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　ＣＰＶ　ＶＰ２　

ｇｅｎｅ　ｗａｓ　１　７５５　ｂｐ．Ｉｔ　ｓｈａｒｅｄ　９８．４　一９９．８　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｏｆ　１３　ＶＰ２　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｔｈｅ　ｐｈｙｌｏ—　

ｇｅｎｅｔｉｃ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｔｒｅｅ　ｗａｓ　ｓｈｏｗｎ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｃｌｏｎｅｄ　ＶＰ２　ＣＳＮ８３０６１　１（ＡＢ０５４２２２）ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｓｈｏｗｅｄ　ｎｏ　

ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｗｉｔｈ　ｏｔｈｅｒ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｆｒｏｍ　Ｊａｐａｎ，Ｉｔａｌｉａ．Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｗｅｒｅ　ｓｈｏｗｎ　ｔｈａｔ　ａ　ｆｕｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　

０ｌ　９０　ｋＤａ　ｗａｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｗｈｉｃｈ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｒｅｃｏｇｎｉｓｅｄ　ｂｙ　ｃａｎｉｎｅ　ａｎｔｉｓｅｒｕｍ　ａｇａｉｎｓｔ　ＣＰＶ．Ｔｈｉｓ　ｒｅｓｕｌｔ　ｗａｓ　ｉｎｄｉ—　

ｃａｔｅｄ　ｔｈｅ　ｆｕｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＳＴ—ＣＰＶ　ＶＰ２）ｐｏｓｓｅｓｓｅｄ　ｓｔｒｏｎｇ　ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｗｈｉｃｈ　ｃｏｕｌｄ　ｈｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ａ　ｒｅｅｏｍｂｉ—　

ｎａｎｔ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｔｏ　ｄｅｖｅｌｏｐ　ａ　ｓｕｂｕｎｉｔ　ｖａｃｃｉｎｅ．　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：　ｃａｎｉｎｅ　ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ；ＶＰ２　ｇｅｎｅ；ｃｌｏｎｉｎｇ；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｒｅａｃｔｉｏｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　

犬细小病毒（Ｃａｎｉｎｅ　ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ．ＣＰＶ）是细小　

病毒科细小病毒属猫细小病毒种的一个宿主变异　

种，为二十面体对称，直径约为２０　ｎｍ，核酸由单股　

收稿日期：２００９—１１一ｌ５　基金项目：新疆维吾尔自治区高新技术项目（２００６１ｌ１０７）　通讯作者：简子健，Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｉｊｉａｎｊｉａｎ２００　１＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．ｃｎ　ＤＮＡ组成，无囊膜Ｄｑ］，犬细小病毒是１９７８年同时　

从澳大利亚和加拿大患肠炎的病犬分离获得　。虽　

发现时间不长，

但迅速在美国、英国、西德和法国、荷　新　疆　农　业　大学　学　报　２ｏ１ｏ年　

兰等国流行，成为犬的一种重要传染病。我国梁士　

哲等１９８２年最早报道了类似ＣＰＶ所致的犬出血性　

肠炎，次年徐汉坤等正式报道了本病的流行口］。中　

国华北、东北、华南、西南等地均有发生和蔓延［６３。　

在世界范围内给养犬业带来了巨大的灾难。目前，　

对ＣＰＶ尚无有效的疗法，对其防制主要是以弱毒　

疫苗免疫预防为主，但弱毒苗在使用过程中也发现　

了一些问题，如能引起免疫抑制、有散毒和发生毒力　

返强的危险及易受母源抗体干扰等。因此，急需研　

制一种安全、有效的新型疫苗来预防这种犬病。由　

于ＶＰ２蛋白是ＣＰＶ衣壳的主要衣壳蛋白，ＣＰＶ的　

主要抗原位点在ＶＰ２蛋白上。研究病毒主要结构　

蛋白ＶＰ２的原核表达及免疫原性鉴定旨在为研究　

ＣＰＶ的抗原性变异和制备更有效的亚单位疫苗奠　

定基础。　

１材料与方法　

１．１材料　

１．１．１粪便样品采集　

在新疆乌鲁木齐市某动物医院采集的病犬粪便　

样品。　

１．１．２试剂、菌株和载体　

ＥｘＴａｑＤＮＡ聚合酶、ＤＬ２０００　ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ、蛋　

白酶Ｋ、各种限制性内切酶和Ｔ４　ＤＮＡ连接酶、载　

体ｐＭＤ１８一Ｔ均购自ＴａＫａＲａ公司。琼脂糖、ＤＮＡ　

Ｍａｒｋｅｒ　ＩＶ购白天根生化科技（北京）有限公司。小　

量质粒提取试剂盒、ＤＮＡ提取试剂盒、Ｇｏｌｄ　Ｖｉｅｗ　

核酸染料、小量胶回收试剂盒、多功能ＤＮＡ纯化回　

收试剂盒均购自北京百泰克生物技术有限公司。酒　

精、Ｔｒｉｓ、ＥＤＴＡ等购自乌鲁木齐华利科析有限公　司。辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的兔抗犬ＩｇＧ二　

抗购自北京博奥森公司。犬细小病毒阳性血清为新　

疆农业大学动物医学学院病理实验室建立的巢式　

ＰＣＲ诊断方法所确定。Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５ａ、ＢＬ２１（ＤＥ３）、　

载体ＰＧＥＸ－４Ｔ一２为本实验室保存。　

１．１．３　引物设计、合成与稀释　

参考ＧｅｎＢａｎｋ犬细小病毒ＶＰ２基因的ＤＮＡ　

序列应用引物设计软件Ｏｌｉｇｏ６．０设计１对特异性　

引物，其中上游引物为ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＡＡＴ—　

ＧＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＣＡＧＴＴ，　下　游　引　物　为　

ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＴＡＴＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＧＴ—　

ＧＣＴＡＧ。引物由上海生工生物工程公司合成。引　

物稀释前对其进行瞬间离心后，加入超纯水，按照上　

海生工生物工程公司ＤＮＡ合成单上的数据进行稀　

释。悬涡振荡１～２　ｍｉｎ，一２Ｏ℃保存备用。　１．２　方法　

１．２．１　病毒ＤＮＡ提取与ＰＣＲ鉴定　

将采集的病料用ｐＨ　７．４的无菌ＰＢＳ悬浮，加　

入青霉素、链霉素，一２Ｏ℃反复冻融３次以上，然后　

在４℃，１０　０００　ｒ／ｍｉｎ离心１０　ｍｉｎ。用０．２２　Ｌ的滤　

膜过滤，收集滤过液。按照ＤＮＡ提取试剂盒说明　

书提取滤过液中的ＤＮＡ。以提纯的犬细小病毒　

ＤＮＡ　２　Ｌ为模板，在上游引物和下游引物各１　Ｌ，　

Ｂｕｆｆｅｒ　５　Ｌ，ＤＮＴＰ　４　Ｌ，Ｔａｑ酶０．５　Ｌ，去离子水　

３６．５　Ｌ的反应体系中进行ＰＣＲ扩增。反应程序　

为：９５℃预变性５　ｍｉｎ，９５℃，４５　Ｓ；５６℃，６０　Ｓ；　

７２℃，２　ｍｉｎ，３０个循环后，７２℃延伸１０　ｍｉｎ，０．８　

的琼脂糖凝胶电泳检测。按胶回收试剂盒说明回收　

目的基因片段。　

１．２．２克隆载体ｐＭＤ１８一Ｔ—ＶＰ２的构建与鉴定　

胶回收的ＰＣＲ产物与ｐＭＤ１８一Ｔ载体分别进　

行双酶切，置１６℃过夜连接，构建克隆载体　

ｐＭＤ１８－Ｔ—ＶＰ２。连接产物转化ＤＨ５ａ感受态细胞，　

并在涂有含氨苄青霉素、Ｘ—ｇａｌ、ＩＰＴＧ的ＬＢ平板　

上，３７℃培养１２　ｈ，挑选白色菌落，筛选，酶切鉴定。　

挑取单个菌落接种于含氨苄青霉素　

（５０　ｔ￣ｇ／ｍＬ）的液体ＬＢ培养基中振荡培养１０　ｈ，小　

量质粒提取试剂盒提取质粒，ＥｃｏＲ　Ｉ、Ｘｈｏ　Ｉ双酶　

切鉴定。将鉴定阳性菌送上海英俊公司和上海桑尼　

公司测序。　

１．２．３　表达载体ＶＰ２一ＰＧＥＸ一４Ｔ一２的构建与鉴定　

０．８％的琼脂糖凝胶回收、纯化ＰＣＲ产物和　

ｐＧＥＸ－４Ｔ一２经ＥｃｏＲ　Ｉ、Ｘｈｏ　Ｉ酶切后连接、转化、涂　

板，挑单克隆经氨苄青霉素抗性和菌落ＰＣＲ初筛，　

提取阳性克隆质粒，经限制性内切酶酶切鉴定后，送　

上海生物工程公司测序。　

１．２．４　ＶＰ２基因的原核表达　

挑选含ＰＧＥＸ一４Ｔ－２一ＶＰ２表达载体的单克隆　

ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株，接种与ｌ０　ｍＬ含氨苄青霉素　

（５０　ｍｇ／ｍＬ）的ＬＢ培养基中，与３７℃、２００　ｒ／ｒａｉｎ　

振荡培养过夜，取１％的菌液接种于１０　ｍＬ含氨苄　

的ＬＢ培养液中，与３７℃振荡培养３．５　ｈ。当０Ｄ　ｓ。ｏ　

：＝＝０．５时，加入终浓度为１．０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ，３５℃　

振荡培养６　ｈ，以无ＩＰＴＧ的培养瓶作为对照，３７℃　

振荡培养６　ｈ。４　０００　ｒ／ｍｉｎ离心５　ｍｉｎ，弃上清收集　

菌体，用１　ｍＬＴＮＥ悬浮菌体，将悬浮菌液装入　

１．５　ｍＬ的ＥＰ管中，加入溶菌酶５　ＩｕＬ，反复冻融３次　

后在冰浴条件下超声波破碎仪破碎３　ｍｉｎ进行　

ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳。