正常和肿瘤组织细胞培养 内容： 正常组织细胞培养： 上皮细胞的体外培养；血管内皮细胞的体外培养；
肾小管上皮细胞的培养； 巨噬细胞的培养； 淋巴细胞的培养 肿瘤细胞培养
不同组织细胞和器官的结构和功能、生长特性不同，在体外培养中所需的分离方法和生长条件也不同。
一、 上皮细胞的体外培养： 许多器官上的上皮细胞具有特定的功能，如肾和肠道上皮细胞具有吸收功能，肝和胰上皮细胞的分泌功能，肺上皮细胞的气体交换功能； 上皮组织还常发生肿瘤。
上皮细胞的基本特征： 1.上皮组织的形态结构： 群体依赖性（population dependence)；接触抑制（contact inhibition) 2.上皮细胞的极性 ： 贴壁依赖性细胞-贴壁生长 生长基质 3 . 上皮细胞间的连接
体外培养的上皮组织细胞的生长生物学 1. 形态学结构： 均质性、透明性很强，结构不明显 2. 体外培养上皮组织的生长与增殖特征 (1) 体外培养的特殊条件： 防范微生物污染； 生长基质的支持； 特殊的培养基（M199 RPMI1640 DMEM Fam F12 无血清培养基）；去成纤维细胞
防范微生物污染 根据上皮组织分布的特性，位于体表或衬贴消化道、呼吸道内等处的上皮组织，直接暴露或同外环境相接触，组织本身带有各种病原微生物或受其污染的机会较多。要求在组织取材时就严格灭菌；分离、种植、培养等诸多操作步骤上都要设法消除可能会出现的微生物污染。培养中所使用的各种液体，包括细胞保存液、分离液以及培养基等需添加抗生素，抗生素浓度比其它组织培养高。
生长基质的支持 皮细胞依赖贴附于某种支持物上才能生长，即所谓的贴壁依赖性细胞。
在培养器皿表面包被生长基质，如胶原或其它细胞外基质成分等，模拟体内的基膜结构，不仅特别有利于上皮细胞的贴附和生长，也有利于培养细胞的分化．使细胞极性表现更为明显。
特殊的培养基 M199和RPMI1640培养基仅适用于上皮组织的短期培养和维持其生存，对上皮组织的长期培养和促增殖作用并不明显。 DMEM和HamFl2培养基用于上皮组织培养时有其特殊作用。可促进上皮细胞的贴附；维持上皮细胞在体外培养状态的分化。HamFl2培养基的特殊性特别适用原代上皮细胞的培养，培养基成分中添加微量元素的无机离子，更加利于细胞的生长和代谢。
在实际培养时，将DMEM与HamFl2按一定比例混合用于上皮组织培养。 培养液特殊添加剂 常用的促细胞生长因子及使用的终浓度
添加剂 终浓度 添加剂 终浓度 BSA 10-5mol/ml EGF 5ng/ml transferrin 5-10 g/ml FGF 5ng/ml insulin 5 pg/ml NGF 5ng/ml 氢化可的松 10-5mol/ml
去除成纤维细胞 上皮组织借薄层基膜和结缔组织相连。取材分离细胞时会带入少量结缔组织成分，常常造成成纤维细胞与上皮细胞混和生长。由于成纤维细胞具有增殖能力和粘附能力强的特点，很容易“疯长”为培养物中的优势细胞群，从而干扰或抑制上皮细胞的生长，成为上皮细胞的“细胞污染源”。
因此在上皮细胞的取材、分离、种植和传代的培养过程中，要特别注意上皮细胞的纯化，去除和抑制成纤维细胞的生长。
(2) 体外培养上皮细胞的形态学变化 体外培养上皮组织细胞的观察与检测 1. 一般形态学观察 光镜： 形态、轮廓、生长情况等。 细胞规则、明亮而饱满、细胞轮廓不清 电镜： 桥粒、形态结构特征、细胞间关系 培养液pH变化： 颜色变化？ 培养物的污染情况： 透明度变化？ 2. 组织化学与免疫组织化学观察与检测 酶类： 碱性磷酸酶； 琥珀酸脱氢酶 特异性抗原标记物： 角蛋白、上皮细胞膜抗原；VIII因子、晶体蛋白、唾液酸糖蛋白
二、血管内皮细胞的体外培养 人脐静脉内皮细胞的培养 1.主要材料：组织来源： 婴儿脐带 培养用液： M199+20%FCS； D-Hanks； 0.1%胶原酶溶液 2.培养方法： 分离细胞培养法 1 ). 将15-20cm长的新生儿脐带放入无菌的PBS溶液中储存。 （注：4℃下最多贮存24小时，室温下不超过6小时，否则废弃） 2 ). 用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的。PBS溶液冲洗3-5次，将污血冲洗干净为止。 3 ). 用手术钳夹紧脐带下端，加入15ml 的胶原酶（1mg/ml）室温下消化15-20分钟，并不时上下摇动脐带。 4 ). 消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50 ml无菌离心管中，用无菌的PBS溶液冲洗脐带2-3次。 5 ).将收集液离心（2000转/分）3分钟，去上清，加入RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置CO2培养箱中培养，两至三天可见细胞长成单层。
5.讨论： (1) 关于接种材料的制备 ： 取材与消化 ； 消化酶、浓度、时间 (2) 排除成纤维细胞：传代去除法 ： 加肝素培养法(90u/ml)； 刮除法 (3) 关于培养液 (4) 关于传代培养
6. 内皮细胞的鉴定： (1) 光镜检查 (2) 透射电镜检查：W-P小体 (3) VIII因子相关抗原的免疫组化检测
三、肾小管上皮细胞的培养 1. 主要材料： a. 细胞来源： b. 无血清培养液： 基础培养液： DMEM/HamF12(1:1) 添加物： 胰岛素 5g/ml；转铁蛋白5 g/ml；硒 5 g/ml；氢化可的松36ng/ml； T3 4 ng/ml； EGF 10 g/ml c. 消化液： 0.2%胰蛋白酶 d. 细胞筛网： 80和100目 2.原代培养： 切取1cm3外层肾皮质、剪碎成1mm3； 80目研磨冲洗、于100目上收集肾小管节段；0.2%胰蛋白酶消化、调整细胞数；接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶进行培养；每隔3~4天，更换培养液 3.传代培养： 4. 培养结果： 3d： 长出细胞； 5~7d ：进入对数生长期； 7~9d： 融合成单细胞层 5.鉴定： 抗角蛋白抗体染色（+） 6.注意事项： a. 分离方法：b. 鉴定方法：
四、巨噬细胞的培养 巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。 巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。 巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。 培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，以小鼠腹腔取材法最为实用。
1、实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤lml（勿注入肠内！），以刺流产生大量的巨噬细胞。 2、引颈处死小鼠。 3、手提鼠尾将其全浸入70%乙醇中3－5秒。 4、置动物于解剖台，用针头固定四肢，持镊撕开腹部皮肤，但勿伤及腹膜壁，把皮肤拉向上下两侧，暴露出腹膜壁。 5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同时用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动。 6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧．使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。 7、小心拔出针头，把液体注入离心管。 8、4℃下250g离心10分钟后，去上清，加10ml DMEM培养基。 9、计数细胞。每只鼠可产生20一30×106细胞，其中90%为巨噬细胞。 10、以3×105个贴附细胞/平方厘米接种。 11、接种数小时后，除去培养液，可去除其它白细胞，纯化培养细胞，用DMEM液冲洗1一2次，再加新DMEM培养液置CO2温箱中。
巨噬细胞的培养 动物： 小鼠、大鼠、兔、人 培养基： Eagle ；MEM ；RPMI1640； HamF12 常用的巨噬细胞： 肺泡和腹腔巨噬细胞
获取巨噬细胞的方法 （一）肺泡巨噬细胞 支气管肺泡灌洗法； 支气管镜肺泡灌洗法 （二）腹腔巨噬细胞 1. 小鼠腹腔巨噬细胞的获取： (1)主要材料：实验动物: 6周龄小鼠 ； 培养液： 10%FCS RPMI1640
巨噬细胞的纯化 1、原理： 巨噬细胞黏附能力强、贴壁快特点 2. 方法： 用帖壁法纯化巨噬细胞 ； 用不连续密度梯度离心纯化巨噬细胞
用帖壁法纯化巨噬细胞 1．用含20％～40％小牛血清的RPMI-1640培养液将巨噬细胞配成2×106～4×106/ml的浓度。以每平方厘米2×105～4×105个巨噬细胞的密度将细胞悬液接种到玻璃培养皿（瓶）或塑料培养皿（瓶）中。37℃ 5％ CO2培养箱中培养1小时或24小时。1小时培养节省时间但会丢失一些粘附力弱的巨噬细胞，而24小时可以得到较多的巨噬细胞。20％～40％的小牛血清可以减少B淋巴细胞的粘附。 2．摇晃培养皿（瓶），悬浮未粘附细胞，吸出细胞悬液。用预温的Hanks液洗涤细胞3～4次。悬浮细胞可重复粘附，得到更多巨噬细胞。用适量含2.5mM EDTA的无钙镁Hanks液消化细胞37℃ 15～30分钟。用吸管吹打分离细胞，离心250×g 10分钟，去上清液。 3．用预冷Hanks液洗涤细胞3～4次，每次离心250×g 10 min，去上清。最后用含10％FBS的RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并测细胞活力，将细胞配成所需浓度。
用不连续密度梯度离心纯化巨噬细胞 1．取15ml离心管，将制备好的各浓度密度梯度材料按下浓上淡的顺序依次分层加在离心管中，每个浓度2ml。最后加上上述巨噬细胞悬液3～5ml（约含2×107～5×107细胞）。 2．4℃中，水平离心1000×g 30分钟，垂直取出离心管，小心吸出各交界面的细胞。分别用预冷的含1％小牛血清RPMI-1640培养液洗涤各交界面细胞2次，每次200×g 10分钟。用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞配成所需的浓度。
巨噬细胞的接种和培养 一）主要材料： 培养液： RPMI1640 等+10~40%FCS+抗生素 （二）实验步骤： a. 冷分离 b. 调整细胞浓度：2~4×106/ml c. 接种培养