人参皂苷测定及其药理作用的研究概况摘要：人参(P anax g inseng C. A. M eyer) 为五加科人参属植物, 具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津、安神等作用〔1〕。
现代药物学研究证明: 人参皂苷(ginsenoside) 是人参中重要的活性物质, 因此人参皂苷含量的多少评价人参内在质量的重要指标之一。
迄今为止, 人们已从人参各部位(人参根、芦头、茎叶、花、花蕾及参果) 共分离得到20 多种人参皂苷, 可分为20S2原人参二醇(p rotopanaxadiol) 类、20S2原人参三醇(p rotopanaxatriol) 类和齐墩果酸(oleanolic acid)类三类。
对于人参中人参皂苷的含量测定, 国内外研究的都比较多, 常用的测定方法主要有: 高效液相色谱法、薄层扫描法、分光光度法及重量法等。
本文主要讨论这些方法测定的结果, 即不同采收期和不同年限的人参中人参皂苷的含量变化, 以及人参各部位人参皂苷的含量变化等, 以期为综合利用人参资源, 扩大人参药用部位, 合理进行人工种植和炮制提供一定参考。
关键词：人参皂苷人参总皂苷八种主要皂苷含量测定药理作用1、人参总皂苷的测定1.1 样品的制备取人参粉（40目）1g，置50ml磨口圆底烧瓶中，精密加入甲醇25ml与沸石少许，摇匀，称重，放置过夜后于水浴中保持微沸回流6小时，添加甲醇至原重离心分离，精密吸取上清液5或10ml（视含量而定），挥去甲醇，将提取物残渣仔细移入1ml容量瓶中，容器用少量甲醇洗涤，洗液合并，精密稀释至刻度。
1.2 总皂苷的测定用微量注射器吸取上述样品溶液10至20μl（视皂苷含量而定），在硅胶薄层上点成线状，用氯仿-甲醇-水（70:55:10）展开，依溶剂达到顶端，将板取出，使溶剂然全挥去，置碘蒸气中数秒，待色点刚显出，立即取出，画出斑点位置，用冷风将碘完全吹尽，用小刀将色点刮入10ml磨口带塞试管中，精密加入5%香荚醛-冰醋酸溶液0.2ml与高氯酸0.8ml，混匀，密塞置60℃水浴中加热15分钟，立即冷却，精密加入冰醋酸5ml，摇匀，离心，取上清液在波长560nm处比色测定，同时取与色点同样大小的空白硅胶加显色剂显色，作为空白对照。
测得的吸收度由人参二醇标准曲线查得相当于人参二醇（A）微克数，由下式计算含量。
生药总皂苷%=A×2.5×100／WW：点药量相当于生药的微克数2.5：Rb组皂苷平均分子量与人参二醇分子量之比。
2、八种主要皂苷的测定2.1 仪器和试药2.1.1 仪器Agilent 1100系列高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），包括G1379A真空脱气机、G1367A自动进样机、G1311A四元泵、G1316A柱温箔和G1315B检测器；KU-DOS-SK2200H超声发射器（上海科导超声仪器公司）；METTLERAE240型十万分之一电子天平（德国梅特勒公司）；DJ-04药材粉碎机（上海淀久公司）2.1.2药品和试剂人参皂苷对照品Rb1、Rb2、Rb3、Re、Rf、Rg1购自中国药品生物制品鉴定所（纯度＞98.0%），Rc、Rd购自上海融禾医药科技发展有限公司（纯度＞98.0%）。
人参药材购自不同厂家:：上海华宇制药有限公司，批号20071121和20071215；上海德康药店，批号20080104和20080409；上海雷允上大药房，批号20080329和20080517.已腈和甲醇为色谱纯，水为哇哈哈纯净水。
2 .2方法和结果2.2.1 对照品溶液的制备精密称取人参皂苷对照品Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1，分别为4.70、5.83、2.09、6.26、6.33、5.18、4.80、5.62mg，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶液并定容至刻度，摇匀，即得浓度分别为470、583、209、626、633、518、480、562μg／ml的母液。
精密量取上述混合对照品溶液0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01ml，分别置1ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得系列浓度的混合对照品溶液，置于4℃冰箱保存。
2.2.2 人参药材样品溶液制备精密称取人参药材粉末（过三号筛）约1.0g，置具塞锥形瓶中，加甲醇30ml，超声30min，降至室温，补足失重，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液，即得，置于4℃冰箱保存。
2.3 色谱条件色谱柱：Agilent zorbax SB-C18（3.0mm×100mm,3.5μm）；流动相为乙腈（A）和水（B），梯度洗脱；A相含量随时间的变化:18%~20%（0~14min）,20%~29%(14~20min),29%(20~25min),29%~37%(25~34min),37%~55 %(34~40min),流速0.6ml/min;检测波长203nm；柱温25℃；进样量10μl。
2.4 方法学考察按出峰顺序，8种人参皂苷Rg1 、Re、Rf 、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd的保留时间分别为：15.713、16.814、23.510、28.599、30.030、31.254、31.677、33.292min。
根据对照品溶液的色谱图中8个峰的相关参数计算系统适应性，其理论塔板数分别为11 529、17 002、156 222、89 949、166 291、222 362、236 437、276 995，分离度分别为:2.00、17.75、16.41、4.23、4.36、1.61、6.28,脱尾因子分别为：1.013、0.958、0.987、0.973、0.979、0.981、0.950、0.985。
空白、对照品以及样品的色谱图见图1.图1 空白(A)、对照品溶液（B）及人参样品溶液（C）的HPLC/DAD色谱图1：Rg1 ；2：Re；3：Rf ；4：Rb1；5：Rc；6：Rb2；7：Rb3；8：Rd2.4.1线性关系分别将“2.2.1”项下制备的不同浓度的系列对照品溶液按“2.3”项下色谱条件依次连续进样，分别重复3次，以对照品溶液浓度（X,μg/ml）对峰面积（Y）进行线性回归，呈良好的线性关系（表1）。
2. 4.2 精密度试验取“2. 2. 1”项下制备的人参皂苷系列混合对照品溶液中的第1 、4 、6 三个点作为低、中、高三个浓度点,在1 d 以内分别连续进样3 次,以及连续3 d 分别进样,根据所得峰面积分别考察日内精密度和日间精密度。
结果8 种人参皂苷的日内精密度低浓度点RSD %均< 2. 0 % ,中、高浓度点RSD %均< 1. 5 %; 日间精密度低、中浓度点RSD %均< 2. 0 % ,高浓度点RSD %均< 1.5 % ,表明方法的精密度良好.2. 4. 3 定量限和检测限考察将人参皂苷对照品溶液进行逐级稀释,以信噪比10 z1 时,确定其最低定量限;以信噪比3 z1 时,确定其最低检测限。
8 种人参皂苷Rb1 、Rb2 、Rb3 、Rc 、Rd、Re、Rf 、Rg1 的最低定量限分别为4. 70 、5. 83 、2. 09 、6. 26 、5. 18 、6. 33 、4. 80 、5. 62 μg/ ml ; 最低检测限分别为2. 462 、2. 002 、1. 482 、2. 050 、3. 129 、2. 369 、1. 083 、3. 095 μg/ml 。
样品色谱图(图1C) 中,2 号峰Re 和7 号峰Rb3的信噪比分别为:52. 8 :1 和36. 3 :1 .2. 4. 4 稳定性试验取制备的人参药材样品溶液,分别在0 、2 、4 、6 、8 、12 、24 h 测定8 种人参皂苷的峰面积,考察稳定性。
8 种人参皂苷Rb1 、Rb2 、Rb3 、Rc、Rd、Re 、Rf 、Rg1 峰面积RSD %分别为1. 58 %、1. 81 %、1. 52 %、0. 81 %、1. 13 %、1. 47 %、1. 74 %、1. 96 % ,表明供试品溶液在24 h 内稳定。
2. 4. 5 重复性试验精密称取同一批次人参药材样品5 份,各约1 g ,按“2.2. 2”项下方法分别制成样品溶液,进样分析。
人参中8 种皂苷Rb1 、Rb2 、Rb3 、Rc 、Rd、Re、Rf 、Rg1 的平均含量和RSD %( n = 5) 分别为2. 811 mg/ g (RSD % = 0. 13 %) ,1.366 mg/ g ( RSD % = 1. 70 %) , 0. 715 mg/ g (RSD % =1. 49 %) ,4. 658 mg/ g (RSD % = 1. 44 %) ,3. 171 mg/ g (RSD %= 0. 33 %) , 2. 652 mg/ g ( RSD % = 0. 92 %) , 0. 338 mg/ g(RSD % = 1. 43 %) ,0. 928 mg/ g (RSD % = 1. 62 %) 。
结果表明本方法的重复性良好。
2. 4. 6 加样回收试验精密称取已知含量的同一批次人参样品1 g 共9 份,每3 份为1 组,按低、中、高3 个水平分别加入对照品一定量(样品中各成分含量的50 %、100 %、150 %) ,按“2. 2. 2”项下制备,进样分析,结果8 种人参皂苷Rb1 、Rb2 、Rb3 、Rc、Rd、Re 、Rf 、Rg1 的回收率和RSD % ( n = 3) 分别为101. 07 % ( RSD % = 1. 07 %) , 98. 72 % ( RSD % = 1. 18 %) ,101. 57 %( RSD % = 1. 01 %) , 101. 71 % ( RSD % = 1. 28 %) ,102. 12 % ( RSD % = 1. 09 %) , 99. 58 % ( RSD % = 0. 93 %) ,98. 62 %(RSD % = 1. 19 %) ,100. 12 %(RSD % = 1. 21 %) 。
结果表明,以本法同时测定8 种人参皂苷的含量回收率结果良好。
2. 5 样品测定按“2. 2. 2”项下方法制备华宇药业、德康药店和雷允上大药房3 个厂家6 个批次的人参药材样品溶液,按“2. 2”项下色谱条件进样分析计算样品含量,结果见表2 。
3.人参皂苷一些药理作用研究3.1人参总皂甙人参总皂甙( GS , ginsenosides)是从五加科植物人参Panax ginseng C. A. Mey. 中提取的主要有效部位。
莫志贤等(2) 研究观察到GS 体外对AA、ADP 和胶原诱导的兔血小板聚集有明显的抑制作用,其效应呈剂量依赖性,50 %聚集抑制率IC50依次为0192 ,2110 ,2170mg/ ml ;以肝素凝血酶凝固时间(HTCT) 表示血小板释放反应的程度,结果GS 对血小板释放反应有明显的抑制作用;以TXA2 的稳定代谢产物TXB2 表示TXA2 含量,实验结果表明, GS1mg/ml 对AA 诱导的TXA2 合成有明显的抑制作用,2mg/ml 对AA、ADP 和胶原诱导的TXA2 合成也有明显的抑制作用;测定游离脂肪酸( FFA) 的含量来表示血小板磷脂酶A2 ( PLA2 ) 活性, 系列浓度( 01125 , 0125 ,015 ,1 ,2mg/ ml) 的GS 可使释放的FFA 量逐渐减少,说明GS 对血小板活性有剂量依赖性抑制作用;按磷酸二酯酶(PDE) 法提取和测定血小板钙调素(CaM) 活性,在Ca2 + 存在下, GS 对CaM 依赖性cAMP2PDE 活性有明显抑制作用, IC50为01039mg/ ml ,进一实验表明,单纯增加PDE 用量或提高CaM 浓度,均只能部分逆转GS(50μg/ ml) 对CaM 依赖性cAMP2PDE 活性的抑制作用,提示GS 对CaM 活性及依赖于CaM 的PDE 活性可能都有抑制作用。