食品工程
ＦＯＯＤ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ２０１１年第２期 ６月出版
固定化木瓜蛋白酶的研究进展
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓ ｏｎ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｐａｉｎ
刘嘉俊 ， 李汴生
（华南理工大学轻工与食品学院，广州５１０６４１） （广东轻工职业技术学院食品与生物工程系，广州５１０３００）
ＬＩＵ Ｊｉａ－ｊｕｎ’－ ＬＩ Ｂｉａｎ－ｓｈｅｎｇ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆＬｉｇｈｔＩｎｄｕｓｔｒｙ ａｎｄＦｏｏｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６４１，Ｃｈｉｎａ） （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＦｏｏｄ ａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ。ＧｕａｎｇｄｏｎｇＩｎｄｕｓｔｒｙＴｅｃｈｎｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０３００，Ｃｈｉｎａ）
摘要木瓜蛋白酶具有水解蛋白质能力强的特点，但游离的木瓜蛋白酶稳定性差，难以回收利用；固定
化木瓜蛋白酶既保持了酶的催化性质，又克服了游离酶的不足，具有广泛的发展前景。 关键词木瓜蛋白酶；固定化；应用
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｐａｐａｉｎ ｈａｓ ａ ｓｔｒｏｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｂｕｔ ａ ｐｏｏｒ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ ｉｓ ｄｉｆｉｃｕｌｔ ｔｏ ｒｅｃｙｃｌｅ．Ｔｈｉｓ ｐａ－ ｐｅｒ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐａｐａｉｎ ｉｎ ｒｅｃｅｎｔ ｙｅａｒｓ．Ａ ｆｉｘｅｄ ｐａｐａｉｎ，ｗｉｔｈ ａ ｂｒｏａｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｍａｉｎｔａｉｎ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ’Ｓ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｂｕｔ ａｌｓｏ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ｔｈｅ ｓｈｏｒｔｃｏｍｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｒｅｅ ｅｎ－
ｚｙｍｅ・ Ｋｅｙｗｏｒｄｓ ｐａｐａｉｎ；ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ；ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ 中图分类号：ＴＳ２６１．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７３—６００４（２０１１）０２—０００８—０３
１木瓜蛋白酶及其固定化应用
木瓜蛋白酶别名为木瓜酶，纯木瓜蛋白酶是有 由２１２个氨基酸组成的单链蛋白质，相对分子质量
为２３ ４０６。制品可含有木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白
酶和溶菌酶等不同的酶，为乳白色至微黄色粉末，
具有木瓜特有的气味，稍具有吸湿性。水解蛋白质 能力强，但几乎不能分解蛋白胨。最适作用温度
６５℃，最适作用ｐＨ为５．０，易溶于水、甘油，不
溶于一般的有机溶剂，等电点为ｐＨ８．７５。 虽然木瓜蛋白酶具有催化能力强，作用底物专
一，反应条件温和等优点，但稳定性差，在温度、
ｐＨ和无机离子等外界因素影响下，容易变性失活， 而且木瓜蛋白酶一般都是在水溶液中与底物反应，
这样酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反
应结束后，即使酶仍有较高活力，也难以回收利 用。这种一次性使用酶的方式，不仅成本较高，而 且难以连续化生产。因此，近年来一直在研究固定
化木瓜蛋白酶技术，人们试图用固定化的方法使木
瓜蛋白酶固定在载体上，并在一定空间范围内进行 催化反应。固定化酶既保持了酶的催化活性，又克
服了游离酶的不足，具有增加稳定性、可反复或连
续使用以及易于和反应产物分开等显著优点。
２木瓜蛋白酶固定化的基本原理
酶的固定化方法有吸附法、包埋法、交联法
等，这些方法各有利弊。载体材料作为固定化酶的
重要部分，其结构和性能对固定化酶的酶学性质有
很大的影响，因此很多学者一直致力于对载体的研
究，以求获得适合于某种酶的价格低廉的载体，以
及操作简便和酶活力回收更高的固定化方法。
刘嘉俊，男，１９８２￣，华南理【大学在职硕士研究生，食 ３ 木瓜蛋白酶的固定化技术 品工程专业，讲师。 收稿日期：２０１１—０４—０６ ３．１
吸附法 ２０１１年第２期 刘嘉俊，等：固定化木瓜蛋白酶的研究进展 ６月出版 ９
近年的研究中关于木瓜蛋白酶的固定化技术使 用较多的是吸附法，吸附法主要有物理吸附法和离
子交换吸附法两种。物理吸附法是以比表面积较大 的物质为载体（无机载体如活性氧化铝、活性碳、
皂土、硅藻土、高岭土、多孑Ｌ玻璃、硅胶，二氧化 钛等；有机载体如面筋、淀粉、纤维素、胶原、塞
璐璐和火棉胶等），其特点是吸附作用选择性不强，
吸附不牢，还会引起吸附变性。离子交换吸附法是
以ＤＥＡＥ一纤维素、ＣＭ一纤维素、ＤＥＡＥ一葡聚糖凝 胶等为载体。２００５年，高波等首次利用冷冻一真空
吸附法在介孔材料ＳＢＡ一１５中固定了木瓜蛋白酶， 与普通的浸渍方法相比，此法不仅可以制备高祖装
量的固定化酶，每克载体固定量可达４５０ ｍｇ，同时
酶的活性仍然保持，并得到较好的固定化酶性质
（如高稳定性），在９Ｏ℃保温３０ ｍｉｎ仍可保留．７０％
的活力。２００５年，沈斌等提出酶的“柔性固定化” 模型，并以Ｍａｎｎｉｃｈ反应得到单载量为０．４ ｍｍｏｌ
ＮＨＪｇ一６．０ ｍｍｏｌ ＮＨＪｇ的胺化苯聚乙酰树脂为载体，
以双醛淀粉为柔性链，对木瓜蛋白酶进行柔性固定
化，酶活回收率可达４０％～５０％，相当于手臂固定 化酶活力率的１．８ ２．４倍，且柔性固定化酶稳定性
较好，该结果说明，酶的“柔性固定化”模型可以 改善传统共价结合固定化及手臂固定化酶活力回收
率不高的缺陷。２００７年，王安明等通过超声条件下
硅酸四乙酯与＾ｙ一氨丙基三乙氧基硅烷的同步水 解，一步制备了带氨基的二氧化硅微球，并在其表
面沉积了银纳米粒子，以此负载银的二氧化硅微
球作为载体固定木瓜蛋白酶，研究了银纳米粒子
负载量对木瓜酶固定化的影响，考察了固定化木 瓜蛋白酶的性能，结果表明，当载体的银负载量
为０．６８ ｇ／１００ｇ时，固定木瓜蛋白酶活回收率达到
最高，比使用未负载银的载体提高了１８８％。该固 定酶比游离酶具有更好的热稳定性，在重复使用２０
次后仍保持原有酶活的４３％，４ ｃｃ下储存２个月后
酶活基本没有下降。 ３．２包埋法
包埋法是用物理或化学的方法把酶包埋在水不 溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的。酶固定化后
一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控
制，能反复多次使用，便于运输和贮存，有利于自
动化生产。２００１年，李红等研究了以壳聚糖微球为
载体固定化木瓜蛋白酶的特性，包括其形态、外观
和酶学性质，结果表明：壳聚糖微球固定化木瓜蛋 白酶是粒径分布范围较均匀的球形微粒，固定化酶
的表观米氏常数Ｋｍａｐｐ（酪蛋白）为０．０５５％，是
溶液酶米氏常数Ｋｍ的０．１３倍，最适ｐＨ为８．０， ｐＨ稳定性在７．０左右，热稳定性在１５℃～３５℃范
围内，操作半衰期为２５ ｄ，该结果为壳聚糖微球固 定化木瓜蛋白酶酶反应器的试制和研究提供了重要
的参考。２００５年，刘琳琳等以磁性金属鳌合琼脂糖
微球为载体，利用金属鳌合配体（ＩＤＡ—Ｃｕ２＋）与蛋
白质表面供电子氨基酸相互作用的原理，定向固定 了木瓜蛋白酶。固定化最适条件为Ｃｕｚ＋１．５×１０ ｍｏｌ／ｇ
载体、固定化时间为４ ｈ、固定化ｐＨ７．０、给酶量 ３０ ｍｇ／ｇ载体。固定化酶的最适反应温度７０℃、
最适反应ｐＨ８．０，固定化酶的热稳定性明显高于溶
液酶，固定化酶活力回收为６８．４％，具有较好的操 作稳定性，载体重复使用５次后固定化酶酶活力为
首次固定化酶的７９．７１％。２００８年，何平等以乙腈
作为有机介质，在微水有机溶剂体系中以 Ｂｏｃ－Ｔｒｐ—ＯＨ和Ｐｈｅ—ＮＨ２为底物，用海藻酸钠、壳
聚糖固定化木瓜蛋白酶催化合成Ｔｒ１）一Ｐｈｅ—ＮＨ：时，
产率为２７．８％，在这一合成反应中，对ｐＨ值、离 子强度、溶液含量、反应温度、酶用量和反应时间
进行正交试验，证明ｐＨ是本合成过程的最重要影 响因素。反应体系以乙腈为有机介质，在微水有机
溶剂体系中以Ｂｏｃ—Ｔｙｒ—Ｐｒｏ—ＯＭｅ和Ｔｒｐ—Ｐｈｅ—ＮＨ２
为底物，用ＩＰＳＡＣ催化合成Ｔｙ卜Ｐｒｏ—ｒＩ —Ｐｈｅ—ＮＩ－Ｉ２， 产率为３５．２％。２００８年，王红玉等以糖和脂质体作
为溶胶一凝胶法固定木瓜蛋白酶（Ｐａｐａｉｎ）过程中
的保护剂，研究了蔗糖、葡萄糖、海藻糖、木糖、
麦芽糖及构成脂质体的正癸烷溶液中胆固醇含量、 卵磷脂与胆固醇质量比等因素对固定化酶活性的影
响。结果表明，８０／ｚＬ２０ ｍｇ／ｍＬＰａｐａｉｎ溶液与１５Ⅱ培
木糖、５００／ｚＬ正癸烷溶液（溶有体积分数１．５％的 胆固醇，卵磷脂与胆固醇质量比为４．５：１）充分混
合后制备的固定化酶活性最高，在优化条件下制备 的固定化酶包封率为４２．０％，活力回收率为
６１．２％；ＳＥＭ分析表明，固定化酶形态呈球状且大
小均匀，内孔分布呈蜂窝状；破膜剂对固定化酶活 性发挥的影响研究表明，ＴｎｔｏｎＸ一１００的效果最好。
固定化酶包埋法是近十余年发展起来的酶应用技
术，在工业生产、化学分析和医药等方面有着诱人
的应用前景。 ３．３交联法的应用
交联法是依靠双功能团试剂使酶分子之间发生 １０ 食品工程 ２０１１年第２期 ６月出版
交联凝集成网状结构，使之不溶于水从而形成固定 化酶。常采用的双功能团试剂有戊二醛、顺丁烯二
酸酐等。酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基 均可参与交联反应。２００４年，黄宜兵等以变性的卵
清蛋白为载体，用戊二醛为交联剂固定木瓜蛋白
酶，通过正交试验考察了固定化ｐＨ值、交联剂戊 二醛浓度、交联时间和酶用量对固定化木瓜蛋白酶
活力的影响，确定了最适固定化条件：戊二醛体积 分数为５％，ｐＨ ６．０、交联时间２０ ｈ，每克载体含酶
量１２ ｍｇ。对比研究了游离木瓜蛋白酶和固定化木
瓜蛋白酶的性质，所得到的固定化木瓜蛋白酶最适
温度９０℃，最适ｐＨ ９．０，米氏常数５３．６ ｍｇ，ｍＬ，
其热稳定性及耐热性均较游离酶显著提高。２００１ 年，王海英等从８种载体材料中选取自制的氨基含 量约２．８７８ ｍｍｏｌ／ｇ的甲壳质作为固定化载体，采用
吸附交联法，以戊二醛为交联剂，对木瓜蛋白酶进
行固定化。１７．５ ｍｇ／ｇ的固定化酶／载体比例、
ｐＨ６、５℃条件下，先吸附１０ ｒａｉｎ，再以体积分数 Ｏ．７％的戊二醛交联１２ ｈ，所得固定化酶酶活回收可
达５２．０％，酶活力为３．５４ Ｕ／ｇ。固定化酶在６５℃ 以下稳定，溶液酶在５５℃以下稳定；固定化酶在
ｐＨ ７．０以下稳定，溶液酶在ｐＨ ６．０以下稳定。５ ｃＣ
条件下，固定化酶贮藏半衰期为１８３ ｄ，以酪蛋白 为底物，固定化酶的操作半衰期可达２７ ｄ。用固定
化酶水解甲壳胺，产物分子量小于１００ ０００的甲壳
胺低聚糖得率约为４５．５５％。２００５年，肖宁等以介 孔分子筛ＭＣＭ一４１作为载体，戊二醛作为交联剂，
对木瓜蛋白酶进行了固定化，研究了固定化条件对
酶活性及酶活性回收率的影响，并对固定化酶的连 续操作稳定性做了初步探讨。结果表明：当１ ｇ载
体的给酶量为２０ ｍ 固定化温度１０℃～２０℃、
固定化时间２ ｈ、ｐＨ ７．０、戊二醛体积分数０．７５％ 时，木瓜蛋白酶的固定化效果最好，此时酶活性平
均回收率达５５％左右，固定化酶具有良好的连续操 作稳定性，半衰期可达２６ ｄ。２００７年，黄泽元采用
壳聚糖与羧甲基纤维素钠形成胶囊将木瓜蛋白酶固
定化，研究了固定化木瓜蛋白酶的固定化条件。结
果表明：在给酶量为５０ ｍｇ／１００ｍＬ、壳聚糖质量分 数为０．２％、ｐＨ７．５、固定化温度５０ ｃＣ条件下，所得
固定化木瓜蛋白酶活力回收率可达６９．８％。 ４结论
综上所述，固定化酶既保持了酶的催化性质， 又克服了游离酶的不足之处，具有如下显著的优
点。 ａ．酶的稳定性增加，减少温度、ｐＨ、有机溶剂
和其他外界因素对酶活力的影响，可以较长期地保
持较高的酶活力。 ｂ．固定化酶可反复利用或连续使用较长的时间，
提高酶的利用价值，降低生产成本 ｃ．固定化酶易于和反应产物分开，有利于产物
的分离纯化，从而提高产品质量。
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