微生物发酵罐发酵（毕赤酵母）
灭菌前:
室温下校准PH电极，先校6.86零点再4.0斜率（若的发酵pH很长时间是酸性的（如酵母 发酵）用
6.86校正零点，4.0校正斜率；若你的发酵 pH很长时间是碱性的（如某些细菌发 酵）用6.86校正零
点，9.18校正斜率）；
室温下校准溶氧电极，1.0点在不接溶氧电极时候标定， 100%点接上溶氧电极，放置在空气
中较定；或 2.0点在灭菌过程中，温度达到 121度左右压力 0.12mpa左右时候标定，100%
在灭菌结束，降温至发酵温度并稳定， 转速在发酵初始转速， 通气量在发酵初始通气量时候
标定

灭菌：
1.
灭菌，先将各排气阀打开，将蒸汽引入夹套或蛇管进行预热，待罐温升至
80~90C，将排气阀逐渐关小。接着将蒸汽从进气口、排料口、取样口直接通入 罐中
（如有冲视罐也同时进汽），使罐温上升到 118~120°C，罐压维持在
0.09~0.1Mpa （表压），并保持30min左右。
2. 保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀门，待罐内压力低于空气压力后， 向罐内通入无菌 空气，
在夹套或蛇管中通冷却水降温，使培养基的温度降到所需的温度， 进行下一步的发酵 和培养。
（注意压力：灭菌时，总蒸汽管道压力要求不低于 0.3~0.35Mpa，使用压力不低于 0.2Mpa。）

灭菌后
:
A.消耗甘油阶段
1. 灭菌后冷却30 C时：
2. 冷却至30C时，开启搅拌（转速最大）和通气（0.1-1.0vvm）,接通28履水（未
稀 释）调PH5.0;每升加4.35ml的无菌PTM1基础盐；
3. 从摇瓶中接种种子液，DO值为100%开始培养后会消耗，导致 DO值下降， 通
氧气以确保DO值超过20%,速率先为0.1vvm。
4. 发酵过夜甘油被完全消耗（18-24h）,标志为DO值增加到100%）
【每天至少两次取样，测 OD600,湿重，显微观察.将菌体和上清（离心后）在
-80C下保藏，用于后面的分析）】
5. 这个阶段所期望达到的细胞产量为90-150g/L湿细胞。重组蛋白质不产生）

B甘油补料阶段
1. 将12ml/L PTM1加入50%VVM的甘油中，将补料速率设为18.15ml每小时每升
初试发酵液体积）
2. 甘油补料将进行约4h或更长。在本阶段完成后 细胞产量应达到180-220g/L湿 细
胞，但是不会有重组蛋白质的产生）
【4%甘油的是所建议的在补料中的最大水平，更高的甘油浓度将会产生毒害问
题。】
重要:如果溶氧低于 20%，应该停止甘油或甲醇的 补料并且不做任何提高溶氧的
事直到溶氧稳定。这时开始调整搅拌、通气、压力或氧气的补充。
有报道称如果培养基的 pH低于3.0,中性蛋白酶会被抑制。故如果有必要可设为 3.0保持
4-5h甘油补料阶段。

甲醇补料培养
在甲醇补料前甘油都必须消耗干净。
1.12mlPTM1基本盐类每升的100%的甲醇进行诱导。
速率为3.6ml/h每升初试发酵液体积。
开始的2-3h内甲醇会在发酵液中累积，溶氧值会有变化。
2. DO值不能维持在20%以上，停止流加甲醇，等到DO值稳定后继续以当前速 率流
加甲醇。增加搅拌、通气、压力或者氧气的 补充来使DO维持在20%以上

DO值会一直变化。
3•当培养物完全适应利用甲醇 (2-4h)并且甲醇成为其限制性生长因子后，将会 有一
个稳定的DO读数和一个较快的DO稳定时间点(通常不到1min)。在培养 物适应甲
醇后而将流加速率翻倍前在限制条件下保持这个较低的流加速率最少

4调10.9 ml/h到最后 5.—
共加入接近740ml
，约

70h。细胞浓度会最终增加
到 350-450g/L湿细胞

YPD
(100ml)
酵母膏是1g，
蛋白胨2g，
葡萄糖2g0 若固体，再加
2g琼脂粉。
自然pH值约5.4,
刚好是酵母合适 的pH
值。一般不 需要调节pH
o

1h。
然后流加速率增加一倍到约7.3ml/h每升初始发酵液体积。
(2h)

LB
胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L
酵母提取物(Yeast extract) 5g/L 氯化钠
(
NaCI) 10g/L

NaOH 调节 pH7.4
120 C灭菌

BMGY
酵母膏 20
蛋白胨 10
磷酸钾缓冲液(pH6.0)
YNB 13.4
Biotin 生物素 0.004
甘油 10