进出口燕窝及其制品中唾液酸的测定方法
编制说明
1 任务来源
本检验方法标准的制定工作是按照国家认证认可监督管理委员会《关于下达2009年度出入境检验检疫行业标准制（修）订计划的通知》下达的任务而进行的，广东局承担研究制订检验检疫行业标准《出口燕窝及其制品中唾液酸的测定方法》任务，计划编号为2009B488k。考虑到大部分燕窝及其制品来源于进口，本标准改为为《进出口燕窝及其制品中唾液酸的测定方法》。
2 标准制定的意义
传统意义的燕窝是指金丝燕在人烟罕见的海岛悬崖峭壁上喂养育雏鸟而筑造的巢窝，燕窝是传统名贵滋补食品，主要产于东南亚国家和我国南海诸岛。
据有关统计资料表明，我国目前是世界第一的燕窝销售大国，2008年我国的燕窝销售额达到100多亿元。因为物稀价贵，特别是监督执法中缺乏有效的检验鉴别手段，导致市场上出现大量假冒伪劣产品，极大的损害了消费者的利益，扰乱了市场经济秩序。为了从根本上解决燕窝及其制品的真假鉴定难题，确定燕窝及其制品中唾液酸的含量等一系列问题，建立燕窝的定性、定量检测方法是当前工作中的迫切需要。
3 编制规则
本标准遵循GB/T 1.1-2000《标准化工作导则 第1部分：标准 的结构和编写规则》和GB/T 20001.4-2001《标准编写规则 第4部分：化学分析方法》的编写规则。
4 标准编制依据和主要内容
本标准主要参考广东出入境检验检疫局的非标《燕窝及其制品中唾液酸含量的测定方法》。本行标主要制定了燕窝及其制品的样品前处理方法，试样中唾液酸的测定方法，包括二种测定方法：分光光度法与液相色谱-质谱/质谱法，后者还可以对燕窝真假进行确证工作 。
5 燕窝基本信息
5.1 燕窝的常见品种简介
a. 以燕窝的形状区分为：燕盏，燕块（饼），燕条，燕丝，燕碎和燕球等；
b. 以燕窝的颜色分为：白燕（又称官燕），黄燕，血燕三类；
c. 以筑巢的习性分为：屋燕、 洞燕、毛燕、草燕四类。金丝燕筑巢在山洞里形成的燕窝，俗称“洞燕”，金丝燕筑巢在人工搭建的屋子里形成的燕窝，俗称“屋燕”。
5.2 燕窝制品的种类简介
冰糖燕窝(饮品) 、冰糖银耳燕窝、冰糖雪蛤燕窝 、冰糖虫草燕窝、虫草燕窝 、冰糖人参燕窝即食燕窝、胶原蛋白无糖燕窝饮品、浓缩燕窝(饮品)、燕窝提取物和燕窝液等。
5.3 唾液酸的简介
燕窝主要成分包括酸性蛋白等，其特征物质是唾液酸糖蛋白。唾液酸糖蛋白可以在一定的酸性条件下水解出游离的 N-乙酰神经氨酸单体，又名唾液酸。唾液酸(sialic acid)是一类神经氨酸的衍生物，广泛存在于多种生物组织中，是构成细胞膜上糖蛋白和糖脂的重要成分。在大部分哺乳动物组织中发现的唾液酸主要是N-乙酰神经氨酸。唾液酸又称燕窝酸，原因是其在燕窝中含量最高，是燕窝的主要活性成分, 是智力发展催化剂。
表1 唾液酸的信息
CAS编码 131-48-6
英文通用名称 Sialic acid
中文通用名称 唾液酸
英文化学名称 5-Acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galactononulosonic acid
中文化学名称 5-乙酰氨基-3, 5-二脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖
理化性质 分子式 C11H19NO9
结构式
分子量 309.27
性状描述 纯唾液酸是无色的,易溶于水,在水溶液中不发生变旋作用。纯的聚唾液酸是白色不定型高聚合物,在酸的作用下容易降解成单体的唾液酸。聚唾液酸水溶性优良,低黏度,生物相容性好,具有生物可降解性。纯的N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸在水溶液中很稳定, 4℃时贮藏数月不发生变化。如果溶液中含有非常微量的有机酸,其稳定性就受到很大的影响。二乙酰和三乙酰神经氨酸不稳定,在常温下易变成N-乙酰神经氨酸。
作用 唾液酸是一族神经氨酸的衍生物,广泛存在于多种生物组织中,是构成细胞膜上糖蛋白和糖脂的重要成分,同时也是一种天然的大脑营养素, 它能增强婴儿的记忆力和促进智力的发育。
N-乙酰神经氨酸(唾液酸的一种)对病毒从感染的宿主细胞中释放新复制的病毒颗粒具有重要的作用。通过抑制N-乙酰神经氨酸可以干扰和阻止病毒的复制,达到治疗流感的目的。
6 检测方法与技术论证
6.1唾液酸标准曲线的制作
标准曲线：称取唾液酸标准品2mg，溶解定容到10mL，浓度为200µg/mL，再逐级稀释到100µg/mL、50µg/mL、20µg/mL、10µg/mL、5µg/mL。分别取2mL，加入茚三酮指示剂（往2.5
g茚三酮中加入60 mL冰醋酸和40mL盐酸，搅拌溶解）2mL与冰醋酸2mL，摇匀，在100℃水浴中显色10min，取出试管在流动水中迅速冷却，然后倒入1cm 比色皿中，在470nm波长处测定吸光度OD。得出如下表2数据结果。
表2 唾液酸标准溶液对应的吸光度
浓度
（µg/mL） 吸光度
（470nm）
0 0.000
5 0.0407
10 0.1264
20 0.1979
50 0.4083 100 0.8714
200
1.5857
根据上述数据制作标准曲线（见图1），得出唾液酸标准溶液浓度x与吸光度y的关系式：y = 0.0081*x+0.026，相关系数r=0.9986，线性关系良好。
图 1 唾液酸标准溶液浓度对应的吸光度关系图
6.2燕窝的前处理过程
根据样品的状态分为2种前处理，即固态燕窝和液态的燕窝制品。
6.2.1 固态燕窝的前处理过程
取有代表性的燕窝样品（同批燕窝的外观应没有明显差异，色泽、形态、大小等特征基本一致；如果存在明显差异，需充分搅碎混合均匀）先经烘干，去除水分，冷却到室温后采用研钵进行研磨，注意剔除样品含有的杂毛杂草等，然后过100目筛，筛下物即为制备好的燕窝试样，为避免受潮，需尽快称量进行后续操作。
6.2.2 液态燕窝制品的前处理过程
液态燕窝制品通常是用玻璃瓶独立包装，应取整瓶制样打浆均匀，一般会产生泡沫，需静置一段时间等待分层，除去泡沫。当样液清晰可见时，取适量装入透析膜中，扎紧两端，在自流水中透析24小时。透析的作用是采用透析膜（透析膜规格：允许分子量小于10000的物质透过，透析膜宽度在2.5厘米左右。）和自流水来除去燕窝制品中的冰糖等物质，因为冰糖等糖类物质会影响后期的水解、吸光测定步骤，冰糖等小分子物质会穿过透析膜进入到含糖浓度低的自流水。其中燕窝的有效成分因为分子量大于10000，而被保留在透析膜内。透析结束后，剪开膜袋，内容物装入洁净容器，即可进行后续操作（必要时冷藏放置）。
6.3 燕窝酸水解过程的选择及优化
燕窝样品经过酸水解释放出唾液酸，所以酸水解是影响结果的重要步骤，如何选取合适的水解条件是决定唾液酸是否释放完全的关键。本标准实验重点对水解时间、水解酸种类和水解酸浓度进行了单因素实验，以期得到优化的水解条件。
6.3.1 水解试剂的选择
6.3.1.1 水解试剂种类的单因素实验
考虑到试剂的安全与适用性，本试验选取了三种水解试剂：水、盐酸、醋酸。
样品：采用同一白燕盏样品进行对比试验。 唾液酸系列浓度的吸光值
y = 0.0081x+0.026
R 2 = 0.9986
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
溶液浓度 吸光值 470nm 盐酸浓度：10%、20%、30%。醋酸浓度：10%、20%、30%。水：蒸馏水。
酸水解条件：称样品0.12 g，加酸20mL，加沸石，在电热板上加热回流，水解10分钟。
不加酸水解：称样品0.12 g，加水20mL，加沸石，在电热板上加热回流，水解10分钟。
将水解液转移定容到100ml容量瓶中，取部分倒入离心管（装有1.2g硫酸铵）中，3000rpm离心10min。分别取上清液2mL，加入茚三酮指示剂2mL与冰醋酸2mL，摇匀，在100℃水浴中显色10min，取出试管在流动水中迅速冷却，然后倒入1cm 比色皿中，在470nm波长处测定吸光度OD。
所得实验数据见下表3。
表3 不同水解试剂的对比结果
水解试剂种类
及浓度 称样量
g 吸光度OD
470nm 唾液酸含量
% 水解现象观察
30%醋酸 0.1202 1.329 12.71 水解液呈半透明白色
30%盐酸 0.1202 0.301 2.89 水解液呈酱黑色，并有黑色渣体
20%醋酸 0.1202 1.317 12.59 水解液呈半透明白色
20%盐酸 0.1202 0.284 2.72 水解液呈酱黑色，并有少量黑色渣体
10%醋酸 0.1203 1.246 11.91 水解液呈半透明白色
10%盐酸 0.1202 0.352 3.37 水解液呈酱黑色，并有少量黑色渣体
水 0.1202 0.348 3.33 水解液呈半透明白色
结论：盐酸比同浓度的醋酸水解所得唾液酸含量都低，并且颜色呈黑色，不利于观察与比色。水的水解结果也低于20%醋酸及30%醋酸。说明盐酸和水的水解效果比醋酸差。在本实验中，醋酸是理想的水解试剂。
6.3.1.2 水解试剂浓度的单因素实验
在确定了水解试剂是醋酸后，应对其适宜的水解浓度进行单因素实验。
醋酸浓度：5%、25%、50%、75%、95%。水解条件：同上6.3.1.1。对比结果见下表4。
表4 不同水解酸浓度的对比结果
醋酸浓度
% 称样量
g 吸光度OD
470nm 唾液酸含量
% 现象观察
5 0.1218 1.058 9.98 水解过程泡沫多
25 0.1219 1.568 14.79 水解过程泡沫较多
50 0.1216 1.500 14.18 无特殊现象
75 0.1219 1.287 12.14 无特殊现象
95 0.1218 1.018 9. 61 水解液粘稠
0246810121416180255075100醋酸浓度（%）唾液酸含量（%）
图2 不同醋酸浓度的对比结果