新的非肽类内皮素拮抗剂:咖啡酸、阿魏酸王 峰3,刘 敏,杨连春,王京媛,吕 敏,李 菲(中国人民解放军空军总医院,北京100036)摘要 目的:研究桂皮酸类化合物咖啡酸和阿魏酸对内皮素(endothelin21,ET21)生物效应的拮抗作用。
方法:体内ET21iv致小鼠急性死亡、体外血管平滑肌细胞培养、主动脉条收缩试验和ET受体结合试验。
结果:咖啡酸和阿魏酸(ip)能剂量依赖性地显著延长ET21致小鼠急性死亡时间,在离体器官可观察到咖啡酸与阿魏酸能拮抗ET21的缩血管效应;放射性受体2配体结合实验表明,咖啡酸和阿魏酸可竞争性地抑制ET21与其受体的结合。
结论:咖啡酸和阿魏酸为新的非肽类ET拮抗剂。
关键词 内皮素;咖啡酸;阿魏酸;内皮素拮抗剂 内皮素21(endothelin21,ET21)是由21个氨基酸组成的体内活性多肽,除强大而持久的血管收缩作用外,对啮齿类动物和哺乳类动物有多种生物效应,如调节水和电解质平衡、激素分泌,组织细胞增生和血管通透性等[1,2]。
ET21参与多种疾病如高血压、冠心病、脑卒中、心律失常的病理生理过程[3,4]。
对内皮素拮抗剂的研究与开发,为治疗内皮素相关性疾病提供了新的途径。
咖啡酸与阿魏酸为桂皮酸类化合物,普遍存在于当归、川芎等常用植物药中。
为了探讨咖啡酸与阿魏酸的药理作用机理,本研究对咖啡酸及阿魏酸拮抗ET21的作用进行探索。
材料与方法 动物 昆明种小鼠、Sprague2Dawley(SD)大鼠均购自北京医科大学实验动物部。
试剂与仪器 ET21、咖啡酸(caffeic acid, CFA)、阿魏酸(ferulic acid,FLA)购自美国Sigma公司;125I2ET21购于Amersham Pharmacia Biotech,放射浓度317MBq・mL-1,370MBq・mL-1;混合性内皮素受体拮抗剂bosentan由Dr.Volker Breu (Hoffmann La2Roche,Switzerland)惠赠。
MB2III 型酶标检测仪为北京市新技术应用研究所产品。
N IH3T3血管平滑肌成纤维细胞由中国预防医学收稿日期:1999204226基金项目:国家自然科学基金资助项目(39670886)3Tel:(010)66928442,E2mail:wangfeng888@ 科学院病毒研究所韩立群研究员提供,Topcount. NXT(Microplate Scintillation&Luminescence Counter)Pakard BioScience Company产品。
CFA,FLA对ET21致小鼠急性死亡的拮抗作用 体重20±2g,昆明种小鼠,♀♂兼用,随机分组,禁食(不禁水)18h后,分别给予CFA及FLA 各011,110,1010,10010mg・kg-1,ip,对照组给予等容积的生理盐水,30min后给予ET2112nmol・kg-1,iv,观察给ET21后15min内小鼠的存活情况,记录动物数和死亡时间,存活时间超过15min 按15min计。
CFA和FLA对ET21缩血管效应的拮抗作用 体重230±10g,♂SD大鼠,击头致昏后快速摘取胸主动脉,分离结缔组织后,剪成2～3mm宽的血管环,置于Krebs2Henseleit生理溶液(K2H液,p H 7140±0105,95%O2+5%CO2,3710±015℃)中,经张力换能器连台式平衡记录仪(上海大华仪表厂),记录血管张力。
加基础张力2g,以10-7 mol・L-1去甲肾上腺素预激2次。
平衡60min达稳定后,加入ET2110-9mol・L-1,待达到最大收缩效应,分别加入不同浓度的CFA及FLA(以2% DMSO为溶媒,实验用2%DMSO作对照),观察CFA与FLA的作用。
CFA及FLA对ET21致血管平滑肌细胞增殖效应的拮抗作用 取第5代兔主动脉平滑肌细胞(RAVSMC)以传代培养法调整细胞数为1×105・mL-1,接种于96孔培养板(100μL/孔),37℃,5% CO2孵育24h后换以含1%小牛血清和ET2110 nmol・L-1的DM EM培养液继续孵育,加入CFA及FLA考察其对ET21致平滑肌细胞增殖的作用。
于不同培养时间以结晶紫染色后用酶标检测仪在570 nm处测定各孔吸光度(A)值,得到ET21对RAVSMC增殖的时间2效应关系和CFA与FLA对ET21致平滑肌细胞增殖的作用。
咖啡酸、阿魏酸、125I2ET21与NIH3T3结合实验 3T3成纤维细胞用RPM1640培养液调整至105个・mL-1,转移到96孔细胞培养板上,使每孔细胞数为104个,咖啡酸、阿魏酸和bosentan用二甲基亚砜(DMSO)溶解后,用RPM1640培养液稀释成不同浓度(浓度范围为10-10～10-4mol・L-1),按不同浓度梯度加入96孔细胞培养板后,再加入10-9mol・L-1125I2ET21,使体系总体积为300μL, 37℃培养1h后,用缓冲液(20mol・L-1Tris HCl, p H715,10nm MgCl2)经Whatman GF/C滤器洗4次,加50μL闪烁液后进行放射活性计数。
用10-5 mol・L-1bosentan作为非特异性结合管,并用已知的非肽类混合型ET受体拮抗剂bosentan作为阳性对照,判定咖啡酸、阿魏酸拮抗内皮素效能强弱。
数据处理 数据以 x±s表示,进行组间t检验。
结果1 CFA,FLA对ET21致小鼠急性死亡的拮抗作用ET2112nmol・kg-1,iv可引起各组小鼠全部死亡,但死亡时间不同。
小鼠给予CFA,FLA可依剂量地延长ET21引起的小鼠急性死亡时间。
同样剂量下,FLA的拮抗ET21致小鼠急性死亡作用较强。
结果见表1。
T ab1 E ffects of caffeic acid(CFA)and ferulic acid (FLA)dose from011to100mg・kg-1ip on the time of acute death induced in mice by endothelin21(ET2 1)(12nmol・kg-1,iv)in vivo.The data is the time of death in min after ET21administrationDose/Time of death/minmg・kg-1CFA FLAControl 2.24±1.02 2.24±1.020.1 2.33±0.19 3.33±1.841.02.58±0.21 4.04±0.50310 3.19±0.88 5.54±1.06310012.72±3.113314.37±1.8933n=10, x±s,3P<0105,33P<0101vs control group.2 CFA,FLA对ET21缩血管效应的拮抗作用离体大鼠主动脉给予10-9mol・L-1ET21后,可导致动脉收缩。
ET21引起最大动脉收缩后给予CFA,FLA,二者均能拮抗ET21的缩血管效应,且表现明显的剂量依赖性。
结果如图1。
药物浓度2效应曲线经sigmiodal方法拟合后,求得最大效应(E max)和IC50,CFA和FLA最大效应分别为70195%±6130%和92110%±0181%,IC50(×10-6 mol・L-1)分别为1180±0180和01063±01005。
结果表明,FLA对ET21缩血管作用的拮抗效能较CFA强(P<0105)。
Fig1 Concentration2response curves of antagonist effects of caffeic acid(CFA)and ferulic acid(FLA) concentrations from10-4to10-9mol・L-1on vasoconstriction induced by endothelin21(ET21)10-9 mol・L-1on isolated aortic rings of Sprague2Dawley rats i n vit ro( x±s,n=6).○—○CFA;●—●FLA.3 CFA,FLA对ET21致血管平滑肌细胞增殖效应的拮抗作用ET21可刺激RAVSMC增殖,于d2达峰值, d1,d2和d7的细胞增殖率分别为3313%±2510%,5010%±1316%,4010%±9128%,与对照组相比有显著性差异。
根据ET21引起RAVSMC 增殖的时间2效应关系,选定10nmol・L-1ET21与CFA,FLA共孵d2测定细胞染色后A(570nm)值,判断ET21引起RAVSMC增殖效果。
结果表明,CFA,FLA可显著性地拮抗ET21引起的RAVSMC增殖,且该作用表现为浓度依赖性。
结果如表2。
4 咖啡酸、阿魏酸、125I2ET21与NIH3T3细胞结合实验125I2ET21可与3T3成纤维细胞上的内皮素受体特异性结合,当培养液中含有咖啡酸或阿魏酸时, 125I2ET21的结合反应被咖啡酸或阿魏酸竞争性拮抗。
根据结合效应2浓度曲线分析,非肽类混合型内皮素受体拮抗剂bosentan对125I2ET21与ET受体结合的拮抗效能最大,其次为FLA,而CFA作用最小,结合效应2浓度曲线呈平行性右移。
经sigmoidal方法对结合效应2浓度曲线进行拟合,得出bosentan、阿魏酸和咖啡酸拮抗125I2ET21与3T3成纤维细胞ET受体结合的半数抑制浓度(IC50)分别为8113×10-9,8186×10-8和6198×10-7mol・L-1;最大效应分别为102105%,101111%和100130%。
结果见图2。
T ab2 Inhibitory effects of CFA,FLA concentrations from10-8to10-11mol・L-1on RAVSMC proliferation induced by ET21(10nmol・L-1)cultured for48hGroup Control10-1110-1010-910-8CFA 2.4±0.2 1.2±0.133 1.2±0.433 1.2±0.8330.9±0.133FLA 2.4±0.2 1.4±0.333 1.5±0.73 1.2±0.233 1.2±0.433The data is the A value×100. x±s.n=3.3P<0105,33P<0101vs controlgroup.Fig2 Concentration response curve of bosentan, ferulic acid and caffeic acid in the binding of125I2ET2 1to ET21receptor in cultured3T3cells.■—■bosentan;●—●FLA;▲—▲CFA.讨论ET21是迄今为止发现的缩血管活性最强的肽类物质,亦是细胞有丝分裂激动剂。