兽类学报，2015，35（1）：102－109ActaTheriologicaSinica
基金项目：科技基础性工作专项：畜禽重要疫病流行病学调查（2012FY111000）；公益性行业（农业）科研专项：宠物疫病快速诊断与疫苗研究与示范（201303042）；山东省农业重大应用技术创新项目：水貂犬瘟热、细小病毒防制技术研究作者简介：于永乐（1988－），男，硕士研究生，主要从事动物传染病防治与生物制品学研究.收稿日期：2014－06－11；修回日期：2014－12－04*通讯作者，Correspondingauthors，E-mail：zhangchuanmei100@163.com；shanhu67@163.com
水貂肠炎病毒SYBＲGreenI荧光定量PCＲ检测方法的建立
于永乐张传美*杨海燕杨瑞梅张洪亮单虎*（青岛农业大学山东省预防兽医学重点实验室，青岛266109）摘要：根据GenBank登录的水貂肠炎病毒（MEV）VP2蛋白基因的保守序列设计了1对特异性引物，经PCＲ扩增出146bp的目的片段，并克隆到pMD18－T载体上，提取重组质粒经PCＲ及测序鉴定正确后，以10倍梯度稀释质粒作为阳性标准品，绘制荧光定量标准曲线，以此建立一种基于SYBＲGreen荧光染料的定量PCＲ特异性检测水貂肠炎病毒的方法。结果表明：该方法对MEV有很好的特异性，检测灵敏度为34拷贝/μL，且重复性试验变异系数均小于2%。临床检测中，在80份样品中检测到30份阳性样品，高于普通PCＲ和电镜观察方法的检出率。该方法的建立实现了对MEV临床早期快速诊断和定量分析，为毛皮动物MEV的防控提供了可靠的检测方法。关键词：水貂肠炎病毒；SYBＲGreenI；荧光定量PCＲ中图分类号：Q16文献标识码：A文章编号：1000－1050（2015）01－0102－08
DevelopmentofaSYBＲGreenIreal-timequantitativePCＲassayforthedetectionofMinkenteritisvirusYUYongle，ZHANGChuanmei*，YANGHaiyan，YANGＲuimei，ZHANGHongliang，SHANHu*（ShandongKeyLaboratoryofPreventiveVeterinaryMedicine，QingdaoAgriculturalUniversity，Qingdao266109，China）
Abstract：AquantitativePCＲassaywasdevelopedforspecificandsensitivedetectionofminkenteritisvirus.Theprimerpairtargetinga146bpfragmentoftheconservedVP2genewasselectedbasedonalignmentofviralsequencesavailableatGenBank.Theanalyticsensibilityofthisassaywas34copiesofplasmidDNA，andithadhighrepeatabilitywithCV＜2%．Theassaywasevaluatedbytesting80fecalsamplescollectedfromsuspiciouscases.Theresultsshowedthat30sam-pleswerefoundpositiveforthevirusinfection，whichwashigherthanthatofroutinePCＲandelectronmicroscopy.There-forethenewassayprovidesausefulmethodfortherapiddiagnosisofminkenteritisandthepreventionandcontrolofthedisease.Keywords：FluorescencequantitativePCＲ；Minkenteritisvirus；SYBＲGreenI
水貂病毒性肠炎是由水貂肠炎细小病毒（Minkenteritisvirus，MEV）引起的一种腹泻、血便等肠炎症状的烈性传染病，与水貂犬瘟热、阿留申病并称为水貂养殖业三大疫病（高云等，1984）。Schofield（1949）首次发现本病，Wills（1952）分离鉴定了病原，并命名为水貂肠炎病毒。姜廷秀等（1981）首先报道了我国发生水貂细小病毒性肠炎。目前，MEV引起的水貂病毒性肠炎仍广泛流行，严重阻碍毛皮动物养殖业的健康发展，特别是给水貂养殖业带来巨大的经济损失（闫喜军等，2008）。MEV属于细小病毒科（Parvoviridae）细小病
毒属（Parovirus），它是目前动物病毒中形态最小、结构最简单的单链线状病毒之一（Parrish，1994）。该病毒对外界环境变化具有极高的耐受性，在粪便中可存活数年之久，易造成貂场的持续感染。目前针对MEV的鉴定和检测已经有许多方法，如电镜观察、血凝及血凝抑制试验、荧光抗体染色技术、1期于永乐等：水貂肠炎病毒SYBＲGreenI荧光定量PCＲ检测方法的建立
酶联免疫吸附试验、LAMP试验以及PCＲ技术等（王建科等，2008；庄金秋等，2011；Wangetal.，2013），但是这些检测方法所需时间长、操作繁琐、不能进行定量分析且灵敏性不高。荧光定量技术具有特异性强、灵敏度高、省时省力等优点，已经成为当前病毒核酸快速高效检测的主要方法（李安等，2009）。本研究以MEVVP2基因为靶基因，所建立的SYBＲGreenI荧光定量PCＲ方法可用于MEV的快速诊断与监测。1研究方法1.1病毒、细胞及临床样品MEV毒株、犬瘟热病毒（CDV3）、阿留申病毒（ADV）、犬腺病毒（CAV）、E.coliDH5α感受态细胞均由青岛农业大学山东省预防兽医学重点实验室保存。80份来自山东各地毛皮动物养殖场送检的疑似水貂病毒性肠炎病料，采病变严重的水貂的肠道粪便进行检测。1.2病毒DNA的提取按照DNAisoＲegent（Takara，中国大连）说明书提取病毒DNA。1.3引物设计与合成根据GenBank上发表的MEV基因组VP2基因序列，选择保守区设计一对引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。上游：5’－ATGCTTGGGGAGTTTGGT－3’，下游：5’－CTTTAGTTGGTGGCTGAGTAG－3’，扩增片段长度为146bp。1.4常规PCＲ扩增采用25μL反应体系，10×PCＲBuffer2.5μL，dNTP（2.5mmol/L）2μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.5μL，rTaq（5U/μL）0.5μL（Takara，中国大连），MEVDNA2μL，灭菌ddH2O补足25μL。PCＲ反应条件：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃30s共35个循环；72℃终延伸10min。应用S1000TMThermalCyclerPCＲ仪（BIO－ＲAD，美国）进行目的基因的扩增。反应结束后，取5μLPCＲ产物于1.5%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。1.5质粒标准品构建将PCＲ产物进行胶回收和纯化，回收片段与pMD18－T载体（Takara，中国大连）连接，并转化DH5α感受态细胞，挑选转化长出的菌落进行培养，质粒提取试剂盒（天根，中国）进行质粒提取，并将经PCＲ鉴定阳性的质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。用紫外分光光度计（Eppendorf，德国）测定质粒浓度并计算拷贝数，并根据得到的结果将质粒稀释成1×10－2－1×10－10浓度梯度作为标准样品以备制作标
准曲线。1.6SYBＲGreenI荧光定量PCＲ反应体系和条件
反应体系为20μL，10μLLightCycler○Ｒ480
SYBＲGreenIMaster（Ｒoche，德国），上、下游引
物（10μmol/L）各0.4μL，不同稀释倍数的DNA标准模板1μL，灭菌ddH2O补足体系。
阴性对照
组中模板改用1μL灭菌ddH2O。反应条件：95℃
预变性10min；95℃5s，60℃20s，72℃10s，45个循环。熔解曲线分析条件为：95℃10s，65℃30s，95℃continue。应用LightCycler○Ｒ480荧
光定量PCＲ仪（Ｒoche，德国）进行荧光定量PCＲ反应。1.7标准曲线的绘制
将制备的质粒进行10倍倍比稀释，按10－3、
10－4、10－5、10－6、10－75个浓度梯度作标准品，进行实时荧光定量PCＲ反应生成标准曲线。1.8特异性试验
提取CDV、CAV和ADV病毒的DNA（其中CDV为提取病毒ＲNA后经反转录为cDNA），按照
优化的条件进行荧光定量PCＲ，检测该方法的特异性。1.9敏感性试验
将制备的标准样品10倍倍比稀释后，选取10－2－10－109个梯度进行荧光定量PCＲ检测，测
定该方法的敏感性。同时取倍比稀释的质粒作常规PCＲ，比较两者的敏感度。1.10重复性试验
将重组质粒标准品按10倍系列稀释，选择高、中、低浓度的质粒样本，每个稀释度一次进行3个重复，将结果进行统计分析确定其可重复性。1.11临床样品检测
采取临床送检的80份病料用常规PCＲ和SYBＲGreenI荧光定量PCＲ方法进行检测。
2结果
2.1PCＲ扩增及质粒拷贝数测定
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