90第18卷 第9期 2016 年 9 月

辽宁中医药大学学报

JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCMVol. 18 No. 9

Sep .，2016

脾为“后天之本”“气血生化之源”。脾主运化，即将水谷化为精微，并将精微物质吸收传输至全身各脏腑组织的作用。脾气的气化升清和脾阳的温煦是脾主运化的关键。若脾阳虚衰，脾失健运，继而将导致机体出现的一系列证候改变。近来有研究认为[1-3]，“脾主运化”是一个涉及多脏腑、多层次的概念，同时现代研究初步揭示还与机体消化、免疫、血液、神经等系统功能相关，尤其与消化系统的联系最为密切。线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ通过呼吸链在线粒体中参与线粒体氧化磷酸化过程，同时生成ATP，为机体提供能量。Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶通过氧化磷酸化生成供能物质ATP，与能量转换过程相关。因此，本实验采用饮食不节、劳倦过度联合苦寒伤阳药物的方法，建立脾阳虚证大鼠模型，基于线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性测定的结果，探讨脾阳虚状态下，模型大鼠回肠组织中线粒体能量代谢障碍机制，为进一步阐述脾阳虚证证候本质提供更多的实验依据。1 材料1.1 动物及分组 SD大鼠42只，SPF级，雌雄各半，鼠龄3个月，体重（220±17）g，一次性购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：scxk（京）2012-0001]。雌雄大鼠分笼适应性喂养7 d，室温20 ℃~23 ℃，标准固体饲料喂养。将大鼠按照雌雄和体重，采用随机分层分组的方法，分为：正常对照组、脾阳虚模型组和中药反证组，每组各14只。1.2 主要药物和试剂 伤阳药：番泻叶（批号：150906）。附子理中汤组成：附子6 g，党参20 g，白术20 g，干姜6 g，甘草6 g。以上药物均一次性购于辽宁中医药大学附属医院药局。 线粒体呼吸链复合体Ⅰ测试盒、线粒体呼吸链

基于能量代谢相关酶活性改变探析脾阳虚证病理机制翟美丽，于漫，王彩霞（辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847）

摘 要：目的：通过对脾阳虚大鼠回肠组织中线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ和Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP

酶的检测，探讨脾阳虚证状态下大鼠能量代谢障碍的机制。方法：采用经典复合因素塑造脾阳虚大鼠模型，随机分为正常对照组、脾阳虚模型组、中药反证组，行比色法检测各组大鼠模型回肠组织中线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ和Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性。结果：脾阳虚状态下，大鼠回肠组织中线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ和Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均显著减少（P<0.05），经附子理中汤中药治疗后，其活性均有所回升，但仍低于正常组（P<0.05）。结论：脾阳虚证状态下，能量代谢相关酶的活性下降，能量代谢异常，提示可能与脾阳虚证的病理机制有关。关键词：脾阳虚证；线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ；Na+-K+-ATP酶；Ca2+-Mg2+-ATP酶

中图分类号：R223.11，R339.6，R589 文献标志码：A 文章编号：1673-842X (2016) 09- 0090- 03

收稿日期：2016-01-16基金项目：国家自然基金面上项目（81373502）；辽宁省高等学校优秀人才支持计划项目（LR2013043）作者简介：翟美丽（1989-），女，辽宁沈阳人，硕士研究生，研究方向：脾脏象机制的现代研究。通讯作者：王彩霞（1963-），女，辽宁沈阳人，教授，博士研究生导师，博士，研究方向：中医脾脏象理论及其机制研究。

Pathological Mechanism of Spleen Yang Deficiency Syndrome Based on Energy Metabolism Related Enzyme Activity

ZHAI Meili，YU Man，WANG Caixia（Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，Liaoning，China）

Abstract：Objective：To investigate the mechanism of the spleen Yang deficiency rats under the disturbance of energy metabolism by detection of spleen Yang deficiency rats ileum of mitochondrial respiratory chain complexes I，IV and Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase. Methods：By the classical composite factors shape the spleen Yang deficiency rat model，were divided as normal control group，spleen deficiency model group，TCM proof group，compared with colorimetry detected in rat model of ileum in mitochondrial respiratory chain complexes I，IV and Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase activity. The spleen Yang deficiency syndrome，rat ileum in mitochondrial respiratory chain complexes I，IV and Na+-K+-ATP enzyme，Ca2+-Mg2+-ATPase activity decreased significantly（P<0.05），the Fuzi Lizhong Decoction in the treatment of traditional Chinese medicine and its activity has rebounded，but still below the normal group（P<0.05）. Conclusion：Under the condition of spleen yang deficiency，the activity of energy metabolism related enzymes is decreased，and energy metabolism is abnormal，which may be related to thepathological mechanism of spleen Yang deficiency syndrome. Keywords：spleen Yang deficiency syndrome；mitochondrial respiratory chain complex I，IV；Na+-K+-

ATPase；Ca2+-Mg2+-ATPase

DOI：10.13194/j.issn.1673-842x.2016.09.02691

18卷 辽宁中医药大学学报 复合体Ⅳ测试盒、超微量Na+-K+-ATP酶测试盒、超微量Ca2+-Mg2+-ATP酶测试盒，均购于南京建成生物研究所。1.3 主要仪器、设备日本岛津 UV - 265FW紫外分光光度计、北京 LD - 2A 高速离心机、PRECISION恒温水浴箱、BX40显微镜（日本OLYMPUS公司）、切片机（德国莱卡公司RM2245）、包埋机（孝感亚光公司NB72F）、自动组织脱水机（德国莱卡LEICATP1020）、染片机（德国莱卡STAINERXL）。2 方法2.1 建立脾阳虚模型 采用经典的复合因素造模方法[4]，即劳倦过度、饮食不节联合苦寒伤阳药建立脾阳虚证大鼠模型。第一阶段造模共7 d，采用猪油脂灌胃（1 mL/100 g）、喂饲甘蓝[100 g/（只·d）]单双日交替进行，并结合游泳至耐力极限（水深34 cm，水温21 ℃），建立脾气虚模型。从造模第8日开始，符合脾气虚标准的模型大鼠在此基础上予以100%浓度的伤阳药1 mL/（100 g·d）进行灌胃，建立第二阶段的脾阳虚模型。正常对照组给予等量的生理盐水灌胃。从第二阶段开始，中药反证组大鼠给予附子理中汤1 mL/（100 g·d）灌服，按照成人药量的6.25倍计算单位药量，日一剂水煎。其他组大鼠均给予等体积的生理盐水灌服。2.2 实验指标2.2.1 记录大鼠的一般情况造模过程中，详细记录各组大鼠体重、肛温、游泳耐力、饮水量、进食量，观察大鼠的一般状态及粪便质地等，并进行脾虚状态积分。其中脾虚状态积分：粪便质软（1分），便形塘稀（2分），肛周污秽（1分），倦怠、懒动（2分），倦缩聚堆（1分），眯眼（2分），弓背（2分）。2.2.2 各组大鼠回肠组织病理学检测取大鼠回肠组织，10%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色，100倍显微镜下观察病理变化。2.2.3 生化指标的测定采用比色法，对各组大鼠回肠组织中线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶测定。具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。2.3 统计方法采用统计软件SPSS 15.0进行数据的统计分析处理，计数资料采用多组数据的单因素方差分析（one-way ANOVA）；计量资料用x—±s表示，组间比较采用成组t检验；等级资料采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。3 结果3.1 各组大鼠的一般情况变化模型组从第3天开始出现食量减少、形体消瘦、粪便时干时稀、个别大鼠出现便溏。后期出现倦怠、懒动、背毛无光泽、弓背、眯眼、肛周有污物等表现。造模结束时，各组大鼠体一般状态的比较情况如表1所示。由表1可知与各组内对应的正常对照组相比，脾阳虚模型组体重、游泳耐力、肛温均呈显著下调趋势，有统计学意义（P<0.05），但脾虚状态积分呈上升趋势（P<0.05）；经中药干预治疗后，体重、肛温、游泳耐力均有所回升（P<0.05），但为达到正常水平，脾虚状态积分呈现下调趋势（P<0.05），但下调程度不明显。表1 各组大鼠体重、肛温、游泳耐力和脾虚状态积分的比较（x—±s）

组别n体重（g）肛温（℃）游泳耐力（min）脾虚状态积分（分）正常对照组14230±13.236.2±0.136.2±2.31.2±0.2脾阳虚模型组14210±10.8△35.8±0.2△28.3±2.5△4.5±0.4△