分子生物学课程论文

肿瘤基因治疗的研究进展

摘要：基因治疗是一种新的肿瘤治疗手段。抗肿瘤有效基因的筛选、基因治疗方

法的选择、基因治疗的相关载体的选择及其安全性改造的研究逐步深入，使肿瘤

的基因治疗研究进展迅猛，部分基因治疗方案已进入临床试验阶段。然而，肿瘤

基因治疗仍然存在风险。本文对肿瘤基因治疗的应用及所面临的挑战进行综述。

关键词 基因治疗；肿瘤；治疗方法；载体

引 言

随着现代分子生物学及其技术的发展,人们对疾病的认识和治疗手段已进入

分子水平。越来越多的研究资料表明,多种疾病与基因的结构或功能改变有关,

因而萌生了从基因水平治疗疾病的想法。DNA重组、基因转移、基因克隆和表达

等技术的建立和完善,为基因治疗(gene therapy)奠定了基础。 1 肿瘤基因治疗概述

1.1 基因治疗的诞生和发展

早在上个世纪60年代末,美国科学家迈克尔·布莱泽首次在医学界提出了基

因治疗的概念;进入80年代,对基因治疗能否进入临床存在很大争议。直到1990

年,美国国家食品药品监督管理局(FDA)才正式批准了第一个基因治疗临床试验,

美国国立卫生研究院(NIH)进行了世界上首次人体基因治疗的临床试验。一名年

仅4岁患有先天性腺苷脱氨酶缺乏症(ADA)的小女孩,经过基因治疗技术导入正

常的腺苷脱氨酶基因,患儿的免疫能力得以提高,获得了明显的治疗效果。这项临

床试验的成功是当今生物医学发展最重要的篇章。

此后,世界各国都掀起了基因治疗的研究热潮，许多人认为这预示着基因治

疗时代的到来。在华盛顿美国国家历史博物馆有一份DNA研究的历史档案,记载

了自1943年Avery及其同事McLeod、McCarty证明DNA是生命的遗传物质以来

所有发展的里程碑,档案上清楚地显示基因治疗是当今基因生物技术最新的重要

里程碑。

然而,基因治疗的诞生与发展从来就不是一帆风顺的。由于最初基因治疗技

术达不到预期持久稳定的治疗效果,在不断遭到质疑的同时,人们便逐渐对其丧

失兴趣。1999年,美国一位患有先天性鸟氨酸转甲酰酶缺陷症的18岁少年Jesse

Gelsinger,在宾西法尼亚大学人体基因研究所施行基因治疗4天后死去,致使基

因疗法遭受重创,人们对基因治疗的热情骤然间降至冰点。在人们怀疑基因治疗

安全性的同时,美国FDA终止了该大学的8项正在进行中的基因治疗临床试验。

但随后的调查结论证明,问题不在基因治疗本身。死者在治疗前正在发热,其用药分子生物学课程论文

- 2 - 量也明显超过FDA批准的标准且未上报。尸检和实验室检查结果表明,门静脉大

剂量注射重组腺病毒激发了该例患者机体致命的免疫反应,导致多器官衰竭而死

亡。这显然是主诊医师为了尽快将基因治疗推向临床而违规操作的结果,与进行

的基因治疗制品本身无直接关系。由此可见,医师不恰当的违规操作放大了公众

业已存在对该项试验安全性的怀疑。在随后的2002年底到2003年,法国巴黎

Necker儿童医院报道重症联合免疫缺陷综合征(SCID)接受基因治疗的患者中,

有2例出现了类白血病样症状。这2例患儿发生类白血病的原因可能与采用的鼠

白血病病毒(MLV)载体的整合位点有关,MLV插入造血干细胞染色体细胞生长启

动基因LMO2的启动子附近,从而导致某些细胞的失控性生长。这次源于法国的事

件经过媒体的广泛报道和渲染,又一次引发了公众对基因治疗安全性危机的大讨

论。从此,人们对基因治疗的期望跌到了低谷,基因治疗临床试验受到了更严格的

监管,安全示范标准比其他治疗方法设置的都要高。 1.2 基因治疗的现状

时至2009年,基因疗法在经过多年沉寂之后,最近频频传来好消息。先天性

黑矇症、X连锁肾上腺脑白质营养不良、帕金森氏症这三种疾病运用基因治疗取

得成功的案例使得基因治疗逐步摆脱过去失败的阴影,重新燃起新的希望。此外，

《Journal of Clinical Investigation》发表了美国波士顿大学医学院的研究

人员用基因疗法治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏症(alpha-1 anti-trypsin

deficiency)引起的肺气肿的论文,以及报道肌肉萎缩症基因疗法动物实验获得

成功;《Cell》报道抑制IB激酶ε(IKKε)基因表达可治疗肥胖《NatureMedicine》

报道人类首个艾滋病病毒(HIV)感染患者的基因治疗临床试验结果,对74例HIV

成人感染者实施了随机、双盲、安慰剂对照的基因转换Ⅱ期临床试验,接受携带

OZ1分子的血液干细胞有效抑制了HIV病毒的复制,并且未发现与OZ1相关的毒

副作用。这一系列成功的案例,将大大促进基因治疗的发展。2009年岁末,《科

学》杂志评出2009年十大科学突破,位列第七的就是“基因疗法卷土重来”。 1.3 肿瘤基因治疗

在热衷于基因治疗同时,人们最大的期望并不是只想治疗好几个单基因缺陷

症的患者,而真正的目的是要攻克人类健康的头号“杀手”———肿瘤。相对于

单基因缺陷症来说,肿瘤的发生是一个极为复杂的过程,有许多基因的突变会导

致肿瘤的发生。因此,肿瘤基因疗法受到的最大挑战首先是有效基因的筛选,其次

是载体安全性的控制。所选择的目的基因是否只针对癌细胞而不损害体内的正常

细胞?该基因的治疗是否可被精确调控而不会引起其他遗传性改变?癌细胞是否

能被全部清除?因此,随着基因导入系统的改造、表达调控元件的应用以及新的治

疗基因的发现,上述问题将逐步得到解决,基因治疗将会成为恶性肿瘤治疗的重分子生物学课程论文

- 3 - 要组成部分,在肿瘤综合治疗、防止肿瘤细胞的转移与复发等方面发挥重要的作

用。 2 抗肿瘤有效基因的筛选

对肿瘤遗传性改变的深入研究,为肿瘤的基因治疗提供了更多可供利用的目

的基因。根据治疗策略的不同,目的基因可选择原癌基因或肿瘤自分泌生长因子

及其受体基因的反义核酸、抑癌基因、免疫调节因子基因、抗血管生成因子基因、

肿瘤细胞自杀基因、抗肿瘤抗体基因等。针对肿瘤细胞的遗传缺陷,我们设计转

染抑癌基因p16和p53转移使肿瘤细胞的生长受到抑制,诱导细胞凋亡;在体外细

胞学和裸鼠移植瘤实验中证实,对胃癌、肺癌具有良好的抗肿瘤效应,并且在临床

前的安全性评价中未见明显的毒副作用。针对实体肿瘤的微环境,我们构建了携

带抗血管生成基因的腺病毒载体,如Canstatin、Endostatin,在多种人体肿瘤的

动物模型上均能够明显抑制肿瘤微血管的生成,抑制肿瘤细胞生长,诱导细胞凋

亡。为了提高宿主的抗肿瘤免疫能力,我们通过转染γ干扰素基因,不但使机体产

生有效的免疫反应抑制肝癌细胞的生长,而且能够抑制肿瘤血管生长,诱导细胞

凋亡,起到多重杀伤机制。然而，目前有治疗价值的基因还是太少,通过深入细致

地研究肿瘤发生的机制以及基因调控的原理,寻找和筛选更有效的基因,仍然是

我们努力的方向。 3 肿瘤基因治疗的的治疗方法

3.1 自杀基因疗法

自杀基因疗法也称前药转换酶基因疗法,是将能编码某些药物敏感酶的基因

转导入肿瘤细胞,肿瘤细胞产生的这些酶将低毒或无毒的药物前体转化为细胞毒

性产物,以达到杀死肿瘤细胞的目的。其作用是:促进免疫效应细胞的分化增殖、

加强对肿瘤的杀伤力;直接杀伤癌细胞;增加肿瘤细胞的免疫原性。

自杀基因治疗系统的种类很多,主要包括单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶/丙氧

鸟苷(HSV1-tk/GCV)系统、带状疱疹病毒胸腺嘧啶激酶/阿糖甲氧基嘌呤

(VZV-tk/Ara-M)系统、胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)系统和硝基还原酶

/CB1954(NTR/CB1954)系统等。HSV-tk/GCV系统将无毒的药物前体GCV磷酸化,

转变为毒性药物丙氧鸟苷三磷酸。CD/5-FU系统能将无毒的5-FU脱氨酶转变为

5-FU,5-FU再转化为5-FUTP或5-FdUMP,发挥细胞毒性作用,从而杀伤转染基因的

肿瘤细胞,而且基因表达的细胞对邻近未转染的细胞有较强的旁路细胞毒效应

(旁观者杀伤效应)。目前研究较多的是HSV-tk/GCV系统,研究者正在致力于提高

自杀基因疗法的效率。Okada等发现,将表达逆转录包蛋白的复合体载体与腺病

毒载体AVC2、GCEGFP(二者均为腺病毒载体)共同转导可以提高转导的效率,提高

了体外细胞对更昔洛韦前药的敏感性,而对种植于裸鼠的肿瘤抑制率也达到了分子生物学课程论文

- 4 - 50%。

在自杀基因的探索中,不少研究者发现,少量的自杀基因转染的癌细胞与未

转染的癌细胞按一定的比例混合后培养,不仅转染的癌细胞被杀灭,二者相互接

触后相邻的未转染的癌细胞也大量死亡,此即“旁观者效应”。治疗中“旁观者效

应”是一重要特征,即有毒代谢物通过缝隙连接或凋亡小体从转染细胞移动到邻

近细胞,对其产生杀伤作用,大大提高了自杀基因的杀伤效应Ammerpohl等在用

HSV-tk基因治疗脑胶质瘤时发现,作为增强瘤细胞间隙链接的4-丁酸苯酯和更

昔洛韦合用时显著增加了旁观者效应。 3.2 免疫基因疗法

免疫基因治疗是通过基因重组技术,将抗癌免疫增强细胞因子或mhc基因导

入肿瘤组织,增强机体的抗肿瘤免疫功能,达到治疗肿瘤的目的,主要包括增强免

疫效应细胞功能的细胞因子基因疗法、调节增强抗原识别能力的主要组织相容性

复合物的基因疗法和共刺激分子基因疗法等。细胞因子基因疗法是将细胞因子导

入体细胞,提供一个合适的微环境,以有利于提高机体的抗肿瘤免疫应答。 3.3 基因替代疗法

基因替代治疗就是利用载体体内导入野生型抑癌基因,替代缺失或异常的抑

癌基因表达,逆转肿瘤细胞的表型、抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡,以达到治疗的

目的。

目前已分离克隆出20余种抑癌基因,p53基因是与人类肿瘤相关性最高的抑

癌基因,肿瘤生成会伴随p53的缺失。p27基因是一种抑癌基因,调控细胞周期并

抑制细胞分裂,其编码的P27蛋白为细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子(CDKI)。

目前研究的抑癌基因还有Fhit及第10号染色体丢失的张力蛋白同源的磷酸酯酶

等,但真正应用到临床,还需要大量的研究。 3.4 反义基因疗法

反义基因疗法就是通过人工合成的寡核苷酸与癌基因编码的mRNA互补结合,

可以抑制mRNA的转录,达到封闭癌基因的目的。目前的治疗方案主要采用反义细

胞癌基因myc、neu、k-ras等，根据碱基互补原则,用人工合成或生物体表达的

特定DNA或RNA片断(反义核酸),抑制或封闭专一靶基因的技术。目前用于反义

治疗的基因有Survivin（凋亡抑制基因）、分化抑制因子(Id)、B细胞淋巴瘤、

cerb-b2基因和增殖细胞核抗原等。 3.5 多药耐药相关的基因疗法

多药耐药(MDR)是指在化疗药物治疗肿瘤中发现的肿瘤细胞的非特异普遍耐

药性。导致肿瘤细胞MDR的一个重要原因是其MDR1基因扩增和过度表达。MDR

相关的基因治疗一般集中在抑制肿瘤细胞的MDR1基因表达,从而增加常规化疗