生物法制备山梨醇的研究进展朱建良　吴振兴(南京工业大学制药与生命科学学院,江苏南京210009)

摘要　山梨醇是一种存在于许多水果中的多羟基化合物,它作为甜味剂、保湿剂、软化剂被广泛用于食品工业、化妆品、药品的生产。综述了利用运动发酵单胞菌(Zymomonasmibilis)发酵生产山梨醇的研究进展,讨论了利用运动发酵单胞菌工业化生产山梨醇的可能性,并将它与化学法生产山梨醇以及利用其他微生物生产山梨醇的方法作了比较。关键词　山梨醇　运动发酵单胞菌　葡萄糖果糖氧化还原酶　葡糖酸

　收稿日期:2006-03-02

作者简介:朱建良(1964～),男,博士,教授,主要研究方向:生物反应过程开发、生物能源新技术的研究

　TheResearchandDevelopmentoftheBioproductionofSorbitolZhuJianliang　WuZhenxing(CollegeofLifeScienceandPharmaceuticalEngineeringofNJUT,JiangsuNanjing210009)

Abstract　Sorbitol,apolyolfoundinmanyfruits,iswidelyusedassweetener,humectantandsoftenerintheproduc2tionoffood,cosmeticandmedicament.TheproductionofsorbitolbyZ.mobiliswasreviewed.Thepossibilitiesforthein2dustrialproductionofsorbitolbyZ.mobiliswerediscussed,andcomparedwiththecurrentchemicalproductionmethodaswellasothermicrobiologicalprocesses.Keywords　sorbitol　Z.ymomonasmobilis　GFORgluconic　acid

为了探索一条利用生物法大规模生产山梨醇和葡糖酸的途径,很多科学家都做出了不懈的努力。本文概述了近年来利用运动发酵单胞菌生产山梨醇的研究进展,并将它与化学法生产山梨醇以及利用其他微生物生产山梨醇的方法作了比较。本文还讨论了山梨醇的性质、应用和市场前景等[1～5]。1山梨醇的性质、应用和工业化生产1.1　山梨醇性质和应用山梨醇(D-sorbitol),又名山梨糖醇,化学名为1,2,3,4,5,6-己六醇,分子式为C6H14O6,相对分子质量为18211。山梨醇在自然界如水果、蔬菜、烟草中广泛存在,特别是在梨、桃中的含量高达10%以上[6]。1872年JosephBoussingault从山梨树果实的果汁中分离出山梨醇[7],山梨醇由此得名。山梨醇的应用很广泛,除作为合成维生素C的原料以外,在医药、食品添加剂、牙膏等行业中用量也很大。1.2　化学法制备山梨醇目前,国内外普遍采用葡萄糖催化加氢法生产山梨醇。催化加氢法的反应式如下

C6H12O6+H2150℃,4.5MPa镍触媒,pH=8.2C6H14O6

具体过程为将浓度为53%左右的葡萄糖水溶液定量加入到高压反应釜中,同时加入葡萄糖质量1%

的镍催化剂,并把pH值调至弱碱性,然后通入高压氢气进行加氢反应。最终可得无色透明液体产品,沉降的镍经回收可再利用[8]。

2运动发酵单胞菌和葡萄糖果糖氧化还原酶2.1　运动发酵单胞菌运动发酵单胞菌最早是从一些植物的发酵液中以及坏掉的苹果酒和啤酒中被分离出来的。它属于革兰氏阴性菌,兼性厌氧,是具有圆端肥粗的杆状细胞,单个或成对,用丝生鞭毛运动,长114～210

μ

m×

410～510μm,较少成短链,在琼脂平板上生长缓

—74—

第20卷第5期2006年5月 化工时刊ChemicalIndustryTimes Vol.20,No.5May.5.2006慢[9],其电镜照片见图2(A)。运动发酵单胞菌能通过脱氧酮糖酸(ED)途径把1mol葡萄糖降解为2mol乙醇和2mol二氧化碳(图1)。这个过程只需消耗1个三磷酸腺苷(ATP),只有2%～5%的碳源用于细胞生长[10]。它同样能利用降解葡萄糖的方法来降解果糖生成乙醇、二氧化碳[10、12]。除了以上这两个单糖,蔗糖也能被运动发酵单胞菌用作碳源。蔗糖首先被降解成葡萄糖和果糖,从而进一步在细胞内代谢或聚合成果聚糖[11、14、16～23]2.2　葡萄糖果糖氧化还原酶Leigh等[4]首次正确地阐明了运动发酵单胞菌生产山梨醇和葡糖酸的代谢路径。他们认为有一个未知的辅助因子把两种酶连接在一起催化葡萄糖和果糖转化为葡糖酸和山梨醇。两年以后,Zachariou和Scopes[5]提出运动发酵单胞菌所特有的葡萄糖果糖氧化还原酶(GFOR)负责把葡萄糖和果糖转化为葡糖酸内酯和山梨醇。葡糖酸内酯又可以通过葡糖酸内酯酶(GL)转化为葡糖酸。葡萄糖果糖氧化还原酶是一个四聚物,它具有4个相似的亚基,每个大约有40000Da[5、25],烟酰胺腺呤二核苷酸磷酸(NADP+)作为GFOR的辅酶,其成熟的酶蛋白位于细胞周质空间。Kingston等[27]发现GFOR的结构与6-磷酸葡萄糖脱氢酶极其相似,认为这两种酶可能都是从一个前体发展而来的。GFOR的作用机制是一个典型的乒乓机制,首先葡萄糖在被转化为葡糖酸的过程中释放出GFOR,然后GFOR将果糖还原成山梨醇[26]。GFOR的生理学功能可能是当细胞在高葡萄糖浓度中生长时对细胞的渗透压进行调节[35]。为了使细胞中的GFOR达到较高的活力,运动发酵单胞菌必须以葡萄糖为唯一碳源[5]。葡萄糖和果糖都是通过葡萄糖转运载体(GLF)进入周质的。山梨醇形成后被一种特殊的载体从周质运输到细胞质[13、15]。当GFOR在细胞外用于生产山梨醇和葡糖酸时,它会变得极不稳定[28～31],但是硫醇试剂和尿素能保护GFOR酶活[28、30～33]。3利用运动发酵单胞菌制备山梨醇3.1　运动发酵单胞菌预处理以及固定化方法的探索在传统的间歇发酵过程中,运动发酵单胞菌利用葡萄糖和果糖发酵生成的主要产物是乙醇,而山梨醇的产量占底物质量的11%

[3](图1)。考虑到在传统

发酵过程中山梨醇的产量太低,Chun和Rogers[35]将运动发酵单胞菌ZM4(ATCC31821)菌株细胞用10%

(V/V)的甲苯进行渗透处理,其目的是将细胞内的大

部分的可溶辅助因子释放出来,而这些因子对于通过ED途径生成乙醇和葡糖酸以及其他代谢产物的整个过程来说是必需的(图2)。Chun和Rogers[35]将运动发酵单胞菌进行固定化以后进行125h连续发酵,整个过程中山梨醇和葡糖酸的浓度维持在80～85g·L-1且生产能力分别为716g(L·h)和7.2g/(L1h)。

1:糖激酶;2:6-磷酸葡萄糖脱氢酶;3:6-磷酸葡糖酸内酯酶;4:6-磷酸葡糖酸脱氢酶;5:2-酮-3-脱氧-6-葡糖酸醛缩酶;6:甘油醛磷酸脱氢酶;7:磷酸甘油激酶;8:磷酸甘油变位酶;9:烯醇酶;10:丙酮酸激酶;11:果糖激酶;12:6-磷酸葡萄糖异构酶;13:葡萄糖果糖氧化还原酶;14:葡糖酸内酯酶;15:葡糖酸激酶;16:丙酮酸脱羧酶;17:乙醇脱氢酶;18:果聚糖蔗糖酶图1　运动发酵单胞菌利用葡萄糖和果糖生产山梨醇、葡糖酸和乙醇的过程

(A)未经渗透处理; (B)渗透处理以后

图2　运动发酵单胞菌细胞的电镜照片

—84—

化工时刊　20061Vol120,No15 化工纵横《Comments&ReviewsinC1I1》Ichikana等[36]报道将运动发酵单胞菌细胞进行干燥处理以后用于将果糖和葡萄糖转化为山梨醇和葡糖酸,发现发酵液中山梨醇和葡糖酸的浓度达到很高的同时乙醇含量很少。这是因为负责把底物转化为乙醇的酶在干燥的细胞中会失活,而GFOR和GL能仍然保持较高活性。Rehr等[37]以葡萄糖作为单一碳源培养菌株运动发酵单胞菌ATCC29191。此菌株能利用浓度为600g·L-1的葡萄糖和果糖的混和物水溶液生产山梨醇和葡糖酸,产量分别达到240g·L-1和210g·L-1。通过进一步实验,从7种渗透剂中筛选出十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)作为最佳渗透剂。并提出使用包括甲苯在内的渗透剂对运动发酵单胞菌的GFOR的活力没有显著的影响,并只需用浓度为011%(V/V)的CTAB处理细胞10min就足以抑制乙醇的产生。BringerMeyer和SahmD[38]将在-20℃下经过渗透处理以后运动发酵单胞菌细胞在室温下解冻以后用来生产山梨醇和葡糖酸,结果两者的产率都接近100%。表1　在不同底物浓度下山梨醇和葡萄糖酸产量和生产能力(葡萄糖+果糖)/(g·L-1)100300400500600650750葡糖酸的产量/(%)7.5405880839190山梨醇的产量/(%)35837479869192葡糖酸的生产能力/(g/[L·h])0.241.31.52.21.61.61.3山梨醇的生产能力/(g/[L·h])0.801.71.61.81.51.51.3-○-葡糖酸　-●-山梨醇　-■-果糖　-□-葡萄糖图3　以浓度为650g·L-1的葡萄糖和果糖混和物水溶液生产山梨醇和葡糖酸的过程但是考虑到山梨醇和葡糖酸相对低的市场价格,要想实行工业化生产,就必须降低成本、简化操作。大部分关于利用运动发酵单胞菌生产山梨醇和葡糖酸的方法都包含对运动发酵单胞菌细胞的渗透处理,

这样做虽然提高了产量,但是同时也增加了成本。Silveira等[24]在用未处理过的运动发酵单胞菌ATCC

29191细胞间歇发酵生产葡萄糖和山梨醇,并研究了底物浓度对产量的影响。使用的浓度为650g·L-1的葡萄糖和果糖混和物的水溶液生产山梨醇和葡糖酸,

操作时间为8h,其产率都达到了91%,而且几乎不产生乙醇。(表1,图3)。从图3和表1可以看出,在一定时间内产物产量会随着底物起始浓度的增加而增加,这是因为:①高渗透压导致了细胞的生存能力的下降;②底物和产物对微生物正常代谢的抑制,使细胞通过GFOR/GL

系统对底物进行优先利用。为了使GFOR具有长期的活力,Jang等人[39]将经CTAB渗透处理过的运动发酵单胞菌细胞在被固定在K-卡拉胶颗粒上之前用戊二醛处理一下可以提高硬度。而用甘油和丙二醇处理过的K-卡拉胶颗粒的硬度将比直接用CTAB

渗透处理过的细胞的硬度高3倍。这些措施都减少了酶活的损失。3.2　底物的选择相对于产物来说底物成本相对较高,特别是果糖。Ro和Kim[40]改用蔗糖为底物生产山梨醇和葡糖酸。他们将用甲苯处理过的运动发酵单胞菌细胞和蔗糖酶固定在几丁质和海藻酸钙颗粒上用来生产山梨醇。当底物蔗糖浓度为200g·L