第29卷　增刊西北农林科技大学学报(自然科学版)Vol.29Suppl.2001年8月Jour.ofNorthwestSci-TechUniv.ofAgri.andFor.(Nat.Sci.Ed.)Aug.2001

线粒体DNA在昆虫系统学研究中的应用u徐庆刚,花保祯(西北农林科技大学昆虫博物馆,陕西杨陵712100)

[摘　要]　综述了mtDNA的组成和各部分的进化特点,以及它们用于昆虫系统学研究的优点。mtDNA进化快的COⅠ～COⅢ、ND5和A+T-rich区部分适合亲缘关系较近类群的系统学研究,进化慢的12srDNA、16srD-NA和ND1、ND2部分适合亲缘关系较远类群的系统学研究。并对mtDNA在昆虫系统学研究中的应用前景作了展望,提出了存在的问题。[关键词]　线粒体DNA;系统学;PCR;昆虫[中图分类号]　Q961 [文献标识码]　A[文章编号]1000-2782(2001)S0-079-05

分子生物学技术近年来发展极为迅速。80年代,聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction,PCR)技术的应用开始了分子生物学技术的革命,特别是“PCR通用引物”(universalPCRprimer)或随机引物(randomprimer)的使用,使人们在不知道物种DNA的任何序列信息时就可以对其扩增[1,2]。PCR技术是在实验室条件下于体外应用酶促扩增特定DNA片段的快速方法,其应用在不断扩展,主要应用于基因组DNA和cDNA直接克隆目的基因并测序、体外诱变和DNA工程、法医遗传指纹鉴定、传染病原分析、遗传病产前诊断、RNA转录物结构分析、基因组足迹分析等[2～8]。PCR技术的使用使得DNA快速测序、RAPD和RFLP的使用极为方便,成本也大大下降,被迅速应用于昆虫系统学研究。研究者主要通过核DNA、rDNA和mtDNA特定片段的PCR扩增分析,对昆虫进行进化生物学和系统学的研究,由于mtDNA自身的一些优点而被研究的最多,且越来越广泛的应用于昆虫进化生物学和分类学研究。近十几年的研究积累了大量昆虫mtDNA方面的资料,其中以果蝇(Drosophila)的mtDNA研究最多,也最为深入,其全序列已经清楚。这对其他昆虫mtDNA的研究极为有利。本文对近十几年来mtDNA在昆虫系统学、进化生物学研究中的应用成果作了总结,旨在为以昆虫mtDNA为材料进行系统学研究提供方便,同时发现尚存在的问题。1　mtDNA的组成和特点昆虫mtDNA是共价闭合的环状双链DNA分子,没有重组、倒位、易位等突变现象,组成相当稳定,严格遵循母系遗传。昆虫的mtDNA大小为15.4～16.3kb[3,4](图1)。

图1　果蝇(Drosophilayakuba)mtDNA各基因的相对位置和转录方向[5]Fig.1　RelatedlocationsandtranscriptiondirectionofmtDNAofDrosophilayakuba

其中包含12s和16s两个核糖体基因(riboso-

u[收稿日期]　2001-03-08[基金项目]　国家自然科学基金资助项目(39570095)[作者简介]　徐庆刚(1972-),男,山东东营市人,硕士,主要从事昆虫进化生物学研究。malRNAgene,rDNA),22个转运RNA基因(transferRNAgene,tDNA),13个蛋白质编码基因(proteincodinggenes)及1个包含复制起点的控制区(controlregion),称为A+T-rich区[4,5]。13个蛋白质编码基因是1个细胞色素b,2个ATP酶亚基基因(6和8),3个细胞色素氧化酶亚基基因(COⅠ,COⅡ,COⅢ),7个NADH降解酶基因(ND1～6及ND4L)。目前对mtDNA研究表明,其不同组成部分的进化速率是不同的。总的来说,tDNA和rDNA在mtDNA中最保守,碱基替代率最低,而蛋白质编码基因相对进化要快一些[6];tDNA内不同功能区的保守程度不同,tDNA的A+T-rich区、T7C环、T臂是最多变的区域,变异最高。此外,不同物种间的tDNA变化速率也不同[7]。2　mtDNA作为系统发育分析的优点2.1　提取工艺简单 mtDNA的分子质量小,结构较简单,细胞中有较高的拷贝数,容易提取、提纯和分析。2.2　具母系遗传特性因遗传过程中严格遵守母系遗传方式,避免了双亲遗传方式引起的随机性[3],只需少量个体材料就能反映群体的遗传结构[8]。2.3　进化速度快线粒体基因组自身缺乏修补机制,复制过程中易产生序列取代的变异,从而进化速率比核DNA快5～10倍[9]。与核DNA相比更适合作进化生物学研究。特别有较低阶元研究方面的优势,是核DNA无法比拟的。3　mtDNA各部分适用的分类阶元(分类水平)进化快的基因和碱基位点适于亲缘关系较近类群的系统学研究,进化慢的则适于远缘类群的系统学研究[10]。因此,选取适当的DNA片段作为不同分类水平的研究材料是很重要的。如用变异很慢的基因研究种及种以下阶元的分析,会因为DNA碱基替代率极低而无法分析;若用变异很快的基因研究较高阶元的亲缘关系,很可能得到错误的或无意义的结果。12srDNA和16srDNA可以很方便地用保守引物(conservedprimer)或通用引物定位并进行PCR扩增,所以对其测序较多。12srDNA和16srDNA进化较慢,适合远缘种的研究。但诸多研究表明[2],12srDNA的非同源相似性(homoplasy)较高,实际上更多用于近缘种关系研究。Simon等[2]在总结了前人用16srDNA对果蝇属(Drosophila)、伊蚊属(Aedes)、蜜蜂属(Apis)、飞蝗属(Locusta)、虎甲属(Cicindela)等的种间、属间系统学分析的结果时认为,16srDNA适用于种、属水平,不适用于种内;16srDNA也适合于角顶叶蝉类(Delto-cephalus-like)叶蝉的族间系统学分析,但同时指出,16srDNA适于对膜翅目昆虫作系统分析,却不适于蜜蜂属的种间分析。Chapco等[11]对黑蝗属(Melanoplus)28个种,Zimmermann等[12]对4个属蝴蝶的16个种用16srDNA作系统学分析,得出相似结论。tDNA很小且高度保守,很少用于系统发育研究。COⅡ基因应用最广泛,Beckenbach等[13]用于果蝇(Drosophilaobscura)的亚种间,得到满意的结果;Chapco等[11]用于黑蝗属(Melanoplus)的种间,得到与形态分类相同的结果;此外Kimura[14]、Sper-ling等[15]也分别对不同昆虫种间亲缘关系进行了分析,都证明COⅡ适合于亚种、种级水平的系统分析。COⅠ基因要比COⅡ保守,COⅠ在种间表现较大的变异[16]。Brown等[17]将COⅠ、COⅡ用于丝兰蛾科(Prodoxidae)10个属的丝兰蛾系统学分析,发现较大的序列差异;Sperling等[15]还将COⅠ应用于云杉色卷蛾(Choristoneurafumiferana)亚种间、Kelley等[18]将COⅠ应用于西松大小蠹(Dendroc-tonusbrevicomis)种内亲缘关系的分析。Sperling等[19]对铁杉尺蛾(Lambdinafiscellaria)3个亚种的COⅠ、COⅡ进行测序分析,解决了形态分类不能解决的问题。Chapco等[11]则将Cytb基因用于黑蝗属的种间分析。在NADH降解酶基因中,ND5进化速度相当快,是做相关种群系统发育研究最有用的基因之一。Pashley等[7]对鳞翅目4科5个种的昆虫ND1基因、Desalle等[20]对果蝇属的ND1、ND2和ND5作了测序,发现在种间变异很小,更适用于目、科等较高的分类阶元。Makita等[21]将ND5应用于虎凤蝶属(Luehdorfia)的种间研究,结果显示,Luehdorfia

的种和外群蝴蝶种间ND5基因差异较大,同属种间ND5基因差异相对要小。

80西北农林科技大学学报(自然科学版)第29卷A+T-rich区比其他基因区变异快,可用于种及种以下水平的亲缘关系分析。但因A+T含量太高,很难得到有用的信息,同时因此区长度变化太大,长的片段便不易PCR扩增[22]。mtDNA的各组成部分的进化情况在不同种群间有差异,这使其使用的普遍性减小,在选择用于相应分类阶元的DNA序列时应考虑多种因素。4　mtDNA的研究方法4.1　mtDNA的提取技术 mtDNA的提取方法已经较为成熟,近似于质粒DNA的提取,可以参考McMichael等[23]和王文等[24]的方法。4.2　随机扩增多态性DNA随机扩增多态性DNA(RandomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)是基于PCR技术发展起来的。RAPD的操作简单,只需较少量的DNA,且不用预先知道所分析的DNA的序列信息,只要选择合适的寡聚核苷酸单链作为引物,就能进行PCR。此外,RAPD不需使用放射性物质标记,减少了环境污染。但RAPD分析所得结果的重复性较差;共迁移问题使具有相同分子质量的扩增产物(可形成共迁移的条带)不一定具有同源性,即很多不同的DNA序列可产生相同的电泳谱带,其潜在的序列差异不能估计[3];RAPD结果一般是显性遗传,不能分析基因型,只能表示样品是否有差异,无法分析样品产生差异的原因。由于RAPD结果受多种条件影响,使研究结果的重复性和可比性较差,因此,RAPD技术尚需标准化[25,26]。4.3　限制片段长度多态性(RFLP)限制片段长度多态性(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)是利用限制性内切酶来切割mtDNA,不同种生物的mtDNA限制酶切点数目和位置不同,切出的DNA片段长度便不同,就出现DNA片段的长度多态性。随后利用酶切图谱进行序列的间接比较。此法的优点是快速、经济、结果(相对RAPD)较可靠。缺点是要有所分析基因组的相关资料;不同的染色方法(放射性物质标记或EB染色)所得DNA片段多态性结果有差异;所切得的DNA片段内的序列变异情况不能分析。4.4　PCR测序PCR测序所需DNA量极少。通过PCR对所提取的DNA扩增,纯化后用于测序[27,28]。通过对mtDNA片段或全序列测定,比较不同物种或个体间的相关序列,探讨其亲缘关系或进化关系。可以从DNA序列的变化基础上更准确地分析各物种间基因的变异,以计算遗传距离,建立遗传物质资料库。这是系统发育研究最可靠,最有效的方法。其缺点是成本相对较高,测序法不适合作大量样本的分析;同时也要取得与所测DNA相关的资料。但随着PCR