２０１１年６月 Ｊｕｎｅ．２０１１ 热带农业科学 ＣＨＩＮＥＳＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＴＲＯＰＩＣＡＬ ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＥ 第３１卷第６期 Ｖｏ１．３１，Ｎｏ．６
利用ＳＲＡＰ分子标记技术鉴定大白菜种子纯度①
严慧玲 ）② 闰树成ｚ）③杨慧民 汲江科 ） 蒋艳霞ｚ】
（１河北省农林科学院经济作物研究所 河北石家庄０５００５１：
２河北冀蔬科技有限公司 河北石家庄０５００５１）
摘要 以大白菜品种多抗３及其父母本为研究材料，利用ＳＲＡＰ（相关序列扩增多态性）分子标记方法，通过 对５４对ＳＲＡＰ标准引物的筛选，获得了能区分大白菜多抗３及其亲本的引物Ｍｅ４Ｆ／Ｅｍ３Ｒ。采ｈｌｅ４Ｆ／Ｅｍ３Ｒ引物对 对５份多抗３系列商品种子纯度进行检验，种子的纯度分别为７５．５％、７２％、８０．５％、６８％和７３％．与田间种植纯 度鉴定结果符合率分别为９４．６％、８９．３％、９３．２％、９５．５％和９１．２５％。说明利用ＳＲＡＰ分子标记方法对多抗３大白 菜一代杂种进行快速、准确的纯度鉴定是可行的 关键词大白菜：ＳＲＡＰ分子标记：品种纯度‘ 分类号￥６３４
Ｐｕｒｉｔｙ Ｔｅｓｔ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃａｂｂａｇｅ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｓｓｐ．Ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ）
Ｆｌ Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｂｙ ＳＲＡＰ Ｍａｒｋｅｒ
ＹＡＮ Ｈｕｉｌｉｎｇ’’ＹＡＮ Ｓｈｕｃｈｅｎｇ ＹＡＮＧ Ｈｕｉｍｉｎ圆ＪＩ Ｊｉａｎｇｋｅ ＪＩＡＮＧ Ｙａｎｘｉａ￣
（１ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｃｒｏｐｓ，Ｈｅｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，
Ｓｈ￣ｉａｚｈｕａｎｇ，Ｈｅｂｅｉ ０５００５ １； ２ Ｈｅｂｅｉ Ｊｉｓｈｕ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ，Ｈｅｂｅｉ ０５００５ １）
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ５４ ＳＲＡＰ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｃａｂｂａｇｅ ｄｕｏｋａｎｇ３ Ｆ１ ｈｙｂｒｉｄｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｐａｒｅｎｔｓ ｂｙ ＳＲＡＰ ｆｓｅｑｕｅｎｃｅ—ｒｅｌ￣ｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）ｍａｒｋｅｒｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｍｅ４Ｆ／Ｅｍ３Ｒ ｃａｎ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ ＦＩ ｈｙｂｒｉｄｓ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｃａｂｂａｇｅ ｄｕｏｋａｎｇ３ ａｎｄ ｉｔｓ ｐａｒｅｎｔｓ． Ｓｅｅｄ ｐｕｒｉｆｉｅｓ ｏｆ ｆｉｖｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｃａｂｂａｇｅ ｄｕｏｋａｎｇ３ Ｆ １ ｈｙｂｒｉｄｓ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ Ｍｅ４Ｆ／Ｅｍ３Ｒ．Ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｆｉｖｅ ｓｈａｒｅｓ Ｆ１ ｈｙｂｒｉｄｓ ｗａｓ ７５．５％，７２％，８０．５％，６８％ａｎｄ ７３％ｂｙ ＳＲＡＰ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ａｃｃｏｒｄａｎｔ ｒａｔｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ＳＲＡＰ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｆｉｅｌｄ—ｐｌａｎｔｉｎｇ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗａｓ ９４．６％、 ８９．３％，９３．２％，９５．５％ａｎｄ ９１．２５％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＳＲＡＰ ａｎａｌｙｓｉｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｔｅｓｔ ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｃａｂｂａｇｅ ｄｕｏｋａｎｇ３． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｃａｂｂａｇｅ；ＳＲＡＰ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）；ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｓｅｅｄ
相关序列扩增多态性（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｍｐｌｉ—
ｆｌｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ．ＳＲＡＰ）是由Ｌｉ等发展的一种新
型的基于ＰＣＲ的标记技术．采用一对引物对开放阅
读框进行扩增［Ｉ］。由于ＳＲｆｉＰ技术简便、快速．不
需预知物种的序列信息，故而优于ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、
ＳＳＲ和ＡＦＬＰ等传统分子标记方法。目前．该标记
技术已用于多种植物的遗传图谱构建、比较基因组 学、种质鉴定和遗传多样性分析等㈨ 冯英利用
ＲＡＰＤ分子标记的方法对５个大白菜杂交品种的种
子纯度进行了鉴定Ｉ７］．田雷等利用ＡＦＬＰ分子标记
的方法对ｌ３个大白菜材料杂交种子的纯度进行了
鉴定［８］．而利用ＳＲＡＰ标记技术对大白菜种子纯度
进行快速、准确的鉴定未见有报道。鉴定种子纯度
是农作物种子质量的最重要指标之一．只有纯度达
①基金项目：河北省财政专项（２００９０５５００２）。 收稿Ｅｌ期：２０１卜０４—２５；责任编辑／古小玲；编辑部Ｅ－ｍａｉｌ：ｒｄｎｋ￣１６３．ｃｏｍ。 ②严慧玲（１９７８￣），女，湖北武汉人，博士。 ③通讯作者。Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｓｈｃｈ２００４＠１２６．ｃｏｍ。
一
５０— 严慧玲等 利用ＳＲＡＰ分子标记技术鉴定大白菜种子纯度
到规定的要求．才能发挥其品种在抗逆性、品质和
产量等诸多方面的优良特性。建立快速、准确、实
用的大白菜杂交种纯度鉴定方法．对保证种子安
全，进行种子质量监控和市场管理．防止给生产造
成损失和保护农民利益．均具有一定的重要意义
对于大白菜杂交种传统的纯度检验多采用田间鉴定
法，它既占用土地．又需耗费较长的时间，影响种
子的及时销售 本试验利用ＳＲＡＰ分子标记方法．
进行大白菜一代杂种纯度的快速鉴定．以使合格种
子尽快应用于生产
１材料与方法
１．１ 材料 供试材料为河北省农林科学院经济作物研究所
白菜课题组提供的大白菜品种多抗３父母本多抗
３一Ｐ１、多抗３一Ｐ２；５份未经加工的商品种子，编号
分别为：多抗３—３１、多抗３—３９、多抗３—３８、多抗
３—２３、多抗３一ｌ２
１．２ 方法
１．２．１ 育苗及大白菜总ＤＮＡ的提取
在室内对大白菜多抗３的父母本进行催芽．出
芽后剥去种皮作为提取ＤＮＡ的材料 ５份多抗３的商
品种子播种于河北省农林科学院经济作物研究所试验
田内，每份种子至少播种５０粒．待长出心叶取各单
株所有叶片为提取ＤＮＡ的材料
ＤＮＡ采用ＣＴＡＢ小量提取法回（略有修改）提取多
抗３父母本及其杂交种各单株的总ＤＮＡ．在１．５ｍＬ
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中加人６５０ Ｌ的ＣＴＡＢ提取缓冲液，研
磨３ｍｉｎ至叶片粉碎；６５￣Ｃ水浴１ｈ；冷至室温，加入 ６５０ Ｌ的氯仿：异戊醇（２４：１ ｖ／ｖ），上下轻轻颠倒
混匀１０ ｍｉｎ：１３０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ；吸取上清
液４００ ，放入预先加好７００ Ｌ冷无水乙醇的
１．５ ｍＬ离心管中．轻轻上下颠倒混匀，１３ ０００
ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ：弃上清液，加入ｌ ｍＬ ７５％乙醇清
洗ＤＮＡ沉淀．室温放置５～１０ ｍｉｎ．１３０００ ｒ／ｍｉｎ离 心１０ ｍｉｎ，弃上清液；加入１００ Ｌ ０．１×ＴＥ（内含
１．５ Ｌ １０ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅＡ），混匀，３７℃水浴１ ｈ；用
１．０％琼脂糖凝胶电泳检测ＤＮＡ质量和浓度。 １．２．２ ＳＲＡＰ扩增
ＳＲＡＰ引物采用Ｗａｎｇ等ｍ 发表的引物．５４对 ＳＲＡＰ标准引物由上海生物＿丁程技术服务有限公司
合成。引物序列分别为：上游序列ＭｅｌＦ、Ｍｅ２Ｆ、 Ｍｅ３Ｆ、Ｍｅ４Ｆ、Ｍｅ５Ｆ、Ｍｅ６Ｆ；下游序列ＥｍＩＲ、Ｅｍ２Ｒ、
Ｅｍ３Ｒ Ｅｍ４Ｒ Ｅｍ５Ｒ Ｅｍ６Ｒ Ｅｍ７Ｒ Ｅｍ８Ｒ Ｅｍ９Ｒ ＰＣＲ
反应体系为：ＤＮＡ模板１５０ ｎｇ、引物各３０ ｎｇ、０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣ１２、
１ Ｕ Ｔａｑ酶，总体积为２０ Ｌ，不足部分用ｄｄＨ２Ｏ补
充 ＰＣＲ扩增在Ｂｉｏｍｅｔｒａ Ｔ一６ｒａｎｄｉｅｎｔ ＰＣＲ仪上进
行，程序为：９４℃预变性３ ｍｉｎ；９４℃变性１ ｍｉｎ，
３５℃退火１ ｍｉｎ．７２℃延伸１．５ ｍｉｎ，５个循环；
９４℃变性ｌ ｍｉｎ．５０℃退火１ ｍｉｎ，７２℃延伸１．５
ｍｉｎ。３５个循环：７２℃延伸１０ ｍｉｎ；８ ０Ｃ保存。电
泳系统采用北京君意的测序电泳槽．扩增产物用
６％的变性聚丙烯酰胺胶电泳检测．７０ Ｗ恒功率电泳
９０ ｍｉｎ．电泳后银染观察。
１．２．３ 田间种植鉴定分析
在河北省农林科学院经济作物研究所试验田内
将大白菜品种多抗３的５份杂交种播种５０株 多
抗３植物学性状为株高５０￣６０ ｃｍ．株展５１ ｃｍ，叶
长５５ ｃｍ，宽３５ ｃｍ，外叶深绿，叶面略皱有茸毛．
叶缘波状，叶柄及主肋为浅绿．球叶合抱，心叶开
放，球顶部尖，球型指数为２．７２，叶球重４～４．５ｋｇ。
净菜率７０．２％［１１］ 根据以上植物学性状来区分本品
种和杂株进行田问种植鉴定
２结果与分析
２．１ 多态性引物对的筛选
分别取５株杂交种单株ＤＮＡ等量混合构建４
个Ｆｌ池，加上多抗３一Ｐ１、多抗３一Ｐ２共６个样本
进行多态引物对的筛选 共利用５４对ＳＲＡＰ引物
进行了ＰＣＲ扩增，获得清晰可见的ＤＮＡ谱带。这
５４对引物组合共扩增出６５３条带．每个引物组合
在４个样本间扩增带的数目在９～ｌ５条不等．扩
增片段大小在１００￣７００ ｂｐ．平均每个引物组合扩
增 ｌ２．１条带
在实验中发现杂交种与其亲本之间的谱带有如
下几种类型：杂交种与双亲谱带相同：杂交种出现
偏母本型：杂交种出现偏父本型：杂交种与双亲有
互补带型：杂交种比双亲多带少带类型。ＳＲＡＰ标
记一般表现为共显性．符合孟德尔遗传规律．杂交
５１— ２０１１年６月 热带农业科学 第３ｌ卷第６期
种应继承亲本的所有谱带．因此以上几种类型中，
以互补型用于杂交种纯度鉴定是最理想的
从这５４对引物组合中筛选到一个引物组合
Ｍｅ４Ｆ／Ｅｍ３Ｒ，其扩增的带型中有两条特异带．一条
特异带出现在多抗３－ＰＩ中．而另一条出现在多抗
３一Ｐ２中。Ｆ。材料中均有这两条特异带，经重复验证
其扩增谱带稳定（图１）。所以，引物组合Ｍｅ４Ｆ／Ｅｍ３Ｒ
能将供试的多抗３杂交种与其相应的亲本利用互补带
图１部分引物对扩增的ＳＲＡＰ图谱 从右到左的ＳＲＡＰ引物对依次为：＾ｆｅ４Ｆ／ＥⅢ３Ｒ、Ｍａｒｋｅｒ、Ｍｅ４Ｆ／Ｅ加２Ｒ、 ￣ｅ４Ｆ／Ｅｍ４Ｒ、Ｍｅ４Ｆ／Ｅｍ５Ｒ、№４Ｆ／ＥⅢ６Ｒ。每对引物中从右到左的材料依次 为：Ｐｌ、Ｐ２、Ｆｌ、Ｆｌ、Ｆｌ、Ｆ１，箭头所示特异带，下同。
型区分开．从而能够清楚地鉴别品种纯度。
２．２ ５份大白菜杂交种种子纯度鉴定 利用引物组合Ｍｅ４Ｆ／Ｅｍ３Ｒ对５份大白菜品种多
抗３杂交种进行ＳＲＡＰ纯度鉴定（图２）．结果表明。
５份大白菜品种多抗３杂交种纯度分别为７５．５％、
７２％、８０．５％、６８％和７３％。ＳＲＡＰ纯度鉴定结果与田
间种植纯度鉴定结果符合率分别为９４．６％、８９．３％、
９３．２％、９５．５％和９１．２５％（表１）。
表１ ５份大白菜杂交种种子纯度鉴定结果（％）
３讨论
蔬菜杂种优势的充分表现取决于种子的纯度．
因此，一代杂种的纯度是种子质量最重要的因素。
一５２一 Ｍ Ｐ２ Ｐ１ ｌ ２ ３ ４ ５ ６ ７ —————．． ———— ８ ９ １ｏｌｌ１２１３ｌ４１５１６ｌ７１８１９ 一 一 ＿ ●－＿＿ ＿——Ｈ—＿—岬—＿— —－柏－ ＿ ４００ －一
２００ ——— —————’ ’ 一＿．＿一－＿・＿ － ＿一 ，， …’一 １０ ０ ｜＿－潮涵 — 謦 ．＿－－＿ｌ－稿 ・藏囊 一 ＊ 图２ Ｍｅ４Ｆ／Ｅｍ３Ｒ引物对对多抗３－２３鉴定结果
田间鉴定杂种的纯度时，需要植株长到一定大小．
具备品种的典型性状后才能确定．这往往影响种子的
及时销售和菜农的生产 种子纯度鉴定不仅要求准
确、快速。还要求成本适中、操作简单。目前常用的
用于杂交种纯度检测的分子标记技术有：ＲＡＰＤ￣ｚ 、
ＡＦＬＰ￣ ］、ｓｓＲｎ４ 等。ＲＡＰＤ分子标记技术使用的引物
较短（１０ ｂｐ），退火温度较低（３７￣３８￣Ｃ），其扩增有一
定程度的错配．所以扩增结果的稳定性较差。ＡＦＬＰ
分子标记技术需要进行酶切、预扩、选扩三个步
骤，操作较复杂、费时、费功，成本较高。ＳＳＲ分
子标记技术是对特定的引物进行扩增．需要大量合
成引物，增加了种子纯度鉴定的成本：同时筛选获
得合适的特异引物过程较慢．从而达不到快速鉴定
种子纯度的目的 而ＳＲＡＰ分子标记的引物长度为
上游１７ ｂｐ、下游１８ ｂｐ。避免了引物过短会导致稳
定性差．过长会导致放射自显影时背景较深的问
题；另外．ＳＲＡＰ在进行种子纯度鉴定时是通过独
特的引物设计对ＯＲＦｓ进行扩增．只需改变引物３
端的３个选择性碱基即可得到大量的引物对：由于
正向引物与反向引物可自由搭配．因此用少量的引
物便可进行多种组合．不仅大大减少了引物合成的
费用，同时也提高了引物的利用效率。本文通过对
５份大白菜种子纯度的鉴定表明．ＳＲＡＰ鉴定结果与
田间种植鉴定结果有较好的一致性．可用ＳＲＡＰ标
记鉴定替代田间种植鉴定．从而克服田间种植鉴定
周期长、易受环境影响等缺点。
参考文献 ［１］Ｌｉ Ｇ，Ｏｕｉｒｏｓ Ｃ Ｆ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ—ｒｅｌａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙ— ｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＳＲＡＰ），ａ ｎｅｗ ｍａｒｋｅｒ ｓｙｓｔｅｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａ ｓｉｍｐｌｅ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ：Ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｍａｐｐｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔａｇｇｉｎｇ ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ，２００１， （下转第６０页）