第２４卷第３期　２０１３年５月　化学　ＣＨＥＭＩＣＡＬ　研究　ＲＥＳＥＡＲＣＨ　中国科技核心期刊　ｈｘｙｊ＠ｈｅｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ　

几种天然植物提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用　

曹伟伟　，朱晓娜　，李明静　

（１．河南大学化学化工学院，河南开封４７５００４；　２．河南大学河南省天然药物与免疫工程重点实验室，河南开封４７５００４）　

摘要：选择合适的溶剂体系，用维生素Ｃ（Ｖｃ）作为阳性对照物，采用分光光度法测定了不同浓度的茶多酚、丹　皮酚及金银花叶子总黄酮提取物（乙酸乙酯相）对酪氨酸酶活性的抑制作用．结果表明：采用１　丙三醇和１　吐温一８０（体积比１：１）混合液作溶剂可显著增加丹皮酚和金银花叶子总黄酮提取物在水中的溶解度；茶多酚、丹　皮酚、金银花叶子总黄酮提取物对酪氨酸酶的活性都有一定的抑制作用，其抑制作用从强到弱依次为Ｖｃ、Ｖｃ：　丹皮酚一１：２（质量比）、Ｖｃ：丹皮酚一１：１（质量比）、茶多酚、茶多酚：丹皮酚一２：１（质量比）、丹皮酚、金银花　叶子总黄酮提取物．　关键词：茶多酚；丹皮酚；金银花叶子；酪氨酸酶；活性；抑制作用　中图分类号：Ｒ　２８２．７１；Ｑ　９４６．９１　文献标志码：Ａ　文章编号：１００８—１０１１（２０１３）０３—０２８８—０５　

Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ　ｂｙ　ｓｅｖｅｒａｌ　ｐｌａｎｔ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　

ＣＡＯ　Ｗｅｉ—ｗｅｉ　，ＺＨＵ　Ｘｉａｏ—ｎａ　，ＬＩ　Ｍｉｎｇ—ｊｉｎｇ　＇。　（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｅｎａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋａｉｆｅｎｇ　４７５００４，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｅｎａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋａｉｆｅｎｇ　４７５００４，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｓｅｖｅｒａｌ　ｐｌａｎｔ　ｅｘｔｒａｃｔｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｔｅａ　ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ，ｐａｅｏｎｏｌ　ａｎｄ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａ—　

ｖｏｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｌｏｎｉｃｅｒａ　ｊａｐｏｎｉｃａ　ｌｅａｖｅｓ（ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　ｅｔｈｙｌ　ａｃｅｔａｔｅ），ｏｎ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ　ｗｅｒｅ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ　ｂｙ　ｍｅａｎｓ　ｏｆ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ　ｗｈｉｌｅ　ｖｉｔａｍｉｎ　Ｃ　ｗａｓ　ａｄｏｐｔｅｄ　ａｓ　ａ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　

ｃｏｎｔｒｏｌ　ｉｎ　ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ　ｓｏｌｖｅｎｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｍｉｘｔｕｒｅ　ｏｆ　１　（ｖｏｌｕｍｅ　ｒａｔｉｏ）ｇｌｙｃｅｒｏｌ　

ａｎｄ　１　（ｖｏｌｕｍｅ　ｒａｔｉｏ）Ｔｗｅｅｎ一８Ｏ　ａｓ　ｔｈｅ　ｓｏｌｖｅｎｔ　ｈｅｌｐｓ　ｔｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｔｈｅ　ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｐａｅｏｎｏｌ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｌｏｎｉｃｅｒａ　ｊａｐｏｎｉｃａ　ｌｅａｖｅｓ．Ａｌｌ　ｔｈｅ　ｔｅｓｔｅｄ　ｐｌａｎｔ　

ｅｘｔｒａｃｔｓ　ａｒｅ　ａｂｌｅ　ｔｏ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ　ｔｏ　ｓｏｍｅ　ｅｘｔｅｎｔ；ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｃａｐａ—　

ｂｉｌｉｔｙ　ｉｓ　ｒａｎｋｅｄ　ａｓ　Ｖｃ＞Ｖｃ／ｐａｅｏｎｏ１　ｗｉｔｈ　ｍａｓｓ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　１：２＞Ｖｃ／ｐａｅｏｎｏｌ　ｗｉｔｈ　ｍａｓｓ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　１：１＞ｔｅａ　ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ＞ｔｅａ　ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ／ｐａｅｏｎｏ１　ｗｉｔｈ　ｍａｓｓ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　２：１＞ｐａｅｏｎｏｌ＞ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｌｏｎｉｃｅｒａ　ｊａｐｏｎｉｃａ　ｌｅａｖｅｓ．　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｔｅａ　ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ；ｐａｅｏｎｏｌ；ｈｏｎｅｙｓｕｃｋｌｅ　ｌｅａｖｅｓ；ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ；ａｃｔｉｖｉｔｙ；ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　

酪氨酸酶（ＴＹＲ）又称多酚氧化酶，儿茶酚氧化酶，广泛存在于植物、动物和微生物中ｌｌ１］．酪氨酸酶是生　物合成黑色素细胞的主要限速酶，抑制酪氨酸酶的活性，可改善皮肤色素细胞中酪氨酸酶的代谢，阻止色素　沉着，达到美白效果＿２］．已应用于美白化妆品中的化学合成美白剂如氢醌则因具有较大的细胞毒性目前已　

较少采用．天然植物提取物具有无毒、安全等特点，因此，天然植物类化妆品的开发研究越来越受到国内外　

广大消费者的青睐，同时具有很大的市场潜力．茶多酚的主要成分是儿茶素　，具有清除人体自由基、祛斑、　防晒等作用Ⅲ．金银花叶子中主要有木犀草素、木犀草苷、忍冬苷等黄酮类化合物　，这些黄酮类物质是一　

收稿日期：２０１２—１０—０８．　作者简介：曹伟伟（１９８７一），女，硕士生，研究方向为天然产物化学．　通讯联系人，Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｍｊｈｅｌｌｅｎ６＠１６３．ｃｏｒｎ．

　第３期　曹伟伟等：几种天然植物提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用　２８９　

种天然的抗氧化剂，具有清除人体中超氧离子自由基及抗衰老等作用，其中木犀草素还具有抗菌、抑酶等作　

用．丹皮酚又称牡丹酚，研究证实　丹皮酚具有抗炎、抗菌、抑制皮肤色素合成、消瘀化斑等作用．鉴于茶多　酚、丹皮酚及木犀草素都具有抑制黑色素形成的特点，本文作者研究其抑制酪氨酸酶活性，为开发天然植物　提取物在美白化妆品领域的应用开辟新的途径．　

大多黄酮类化合物在水中较难溶解，据文献报道ｌ７　常用甲醇、乙醇、ＤＭＳＯ等溶剂溶解黄酮类化合物，　

但我们通过实验发现甲醇、乙醇、ＤＭＳＯ对酪氨酸酶均有很强的抑制作用．本文通过大量实验筛选出了既可　

以增大金银花叶子总黄酮及丹皮酚在水中的溶解度同时对酪氨酸酶活性又不产生影响的新溶剂体系，即　１　丙三醇和１　吐温一８０（体积比１：１）混合溶液作为溶剂体系，并分别研究了茶多酚、丹皮酚、金银花叶子　

总黄酮提取物等对酪氨酸酶活性的抑制作用．　

１　实验部分　

１．１材料与试剂　酪氨酸酶（９６５　Ｕ／ｍｇ），Ｌ一多巴胺（Ｌ—ＤＯＰＡ），购于上海宝曼生物科技有限公司；茶多酚，实验室自制（从　信阳毛尖中提取，纯度８５　）；金银花叶子乙酸乙酯提取物，实验室自制（以芦丁做标准品测得总黄酮含量为　

８６　）；丹皮酚，实验室自制（从牡丹皮中提取，纯度９９　）；Ｖｃ，丙三醇，吐温一８０，Ｋ　ＨＰＯ　・３Ｈ。Ｏ，ＫＨ。ＰＯ　等　

试剂均为国产分析纯；二次蒸馏水．　１．２仪器　

紫外可见分光光度计，北京莱伯泰科仪器有限公司；ＤＦ一１０１Ｓ集热式恒温加热磁力搅拌器，河南省豫华　仪器有限公司．　１．３实验方法　１．３．１　测定溶液的配制　二次蒸馏水作溶剂，配制０．０１０　ｍｏｌ／Ｌ的多巴胺溶液，５０　Ｕ／ｍＬ的酪氨酸酶溶液．　

１　的丙三醇和１　吐温一８０（体积比１：１）混合液做溶剂，分别配制质量浓度为０．２５　ｇ／Ｌ的Ｖｃ溶液、　

４．００　ｇ／Ｌ的金银花叶子总黄酮提取物溶液、１．２０　ｇ／Ｌ的茶多酚溶液、１．０６　ｇ／Ｌ的丹皮酚溶液．　１．３．２提取物对酪氨酸酶活性的抑制率计算。。　０］　

按照如下公式计算Ｖｃ、茶多酚、丹皮酚、金银花叶子总黄酮提取物及复配物对酪氨酸酶活性的抑制率　

酪氨酸酶抑制率一　二　二　垒＿二　×１００％　ｎ１——　２　式中，Ａ　是加酪氨酸酶，不加提取液，只加多巴胺溶液时的吸光度；Ａ。是加酪氨酸酶，不加提取液，不加多巴　胺溶液时的吸光度；Ａ。是加酪氨酸酶，加提取液，加多巴胺溶液时的吸光度；Ａ　是加酪氨酸酶，加提取液，不　

加多巴胺溶液时的吸光度．　

２结果与讨论　

２．１溶剂的选择　据文献报道　］，提取黄酮类、多酚类物质常用甲醇、乙醇、ＤＭＳＯ等做溶剂．但我们通过实验发现甲醇、　

乙醇、ＤＭＳＯ对酪氨酸酶均有很强的抑制作用．丹皮酚和金银花叶子提取物在水中溶解度较小，有文献报　

道Ｉ１　表面活性剂对难溶化合物具有一定的增溶作用，本实验通过加入表面活性剂显著增大了丹皮酚和金银　

花叶子提取物在水中的溶解度．通过实验选择了既可以增大黄酮类化合物在水中的溶解度，同时对酪氨酸　酶活性又不产生影响的溶剂体系，实验分别选取１　丙三醇、１　吐温一８０、０．５　丙三醇和０．５　吐温一８０（体　积比１：１）、１　丙三醇和１　吐温一８０（体积比１：１）、二次水、甲醇、乙醇、ＤＭＳＯ等溶剂体系．　以多巴胺为底物，３５℃恒温条件下，向１０　ｍＬ比色管中加入５０　Ｕ／ｍＬ的酪氨酸酶溶液２．０　ｍＬ，３．５　

ｍＬ的磷酸盐缓冲液（ｐＨ一６．５），再加入浓度为０．０１０　ｍｏｌ／Ｌ多巴胺溶液２．０　ｍＬ，分别用１　９／５丙三醇、１％吐　

温一８０、０．５　丙三醇和０．５　吐温一８０（体积比１：１）、１　丙三醇和１％吐温一８０（体积比１：１）、二次水、甲醇、　乙醇、ＤＭＳＯ定容，摇匀，同时开始计时，在４７５　ｎｍ处测定吸光度Ａ，开始６　ｍｉｎ每分钟测一次，以后每隔２　

ｍｉｎ测一次，至１２　ｍｉ

ｎ．结果如图１所示．实验结果表明除甲醇、乙醇、ＤＭＳＯ以外的上述其他溶剂体系对酪　２９Ｏ　化学研究　

氨酸酶活性均没有影响，并且其中１　丙三醇和１　吐温－８０（体积比１：１）溶剂体系可显著增大丹皮酚和金　银花叶子提取物在水中的溶解度，故选择１　丙三醇和１　吐温一８Ｏ（体积比１：１）混合液作为溶剂体系．　

２．２不同植物提取物对酪氨酸酶的抑制作用　２．２．１　Ｖｃ对酪氨酸酶的抑制　

３５℃恒温条件下，向１Ｏ　ｍＬ比色管中加入２．０　ｍＬ酪氨酸酶溶液，３．５　ｍＬ磷酸盐缓冲液，再分别加入　

０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１　ｍＬ　０．２５　ｇ／Ｌ　Ｖｃ溶液，最后加入２．０　ｍＬ多巴胺溶液，定　容，恒温２　ｍｉｎ，在４７５　ｎｍ处测定吸光度，按照１．２．２的方法计算抑制率．不同浓度的Ｖｃ对酪氨酸酶活性的　

抑制作用如图２所示，实验结果表明随着Ｖｃ浓度的增大，对酪氨酸酶的抑制作用增强，抑制率达到５０　的　Ｖｃ质量浓度（ＩＣ　。）为１４．５１　ｍｇ／Ｌ．Ｖｃ能够显著地抑制细胞黑色素形成，也是公认的祛斑美白剂．　

１．１　丙三醇２．１　吐温一８Ｏ　３．０．５　丙三醇和０．５　吐温一８Ｏ　４．１　丙三醇和１　吐温一８０　５．二次水６．甲醇７．乙醇８．ＤＭＳ０　图１　不同溶剂对酪氨酸酶活性的影响　Ｆｉｇ．１　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｏｌｖｅｎｔｓ　ｏｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ　图２　Ｖｃ对酪氨酸酶的抑制作用　Ｆｉｇ．２　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｖｃ　ｏｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ　

２．２．２　茶多酚对酪氨酸酶的抑制　３５℃恒温条件下，向１０ｍＬ比色管中加入２．０　ｍＬ酪氨酸酶溶液，３．５　ｍＬ磷酸盐缓冲液，再分别加入　

０．１、０．３、０．５、０．７、０．９、１．１、１．３、１．５、１．７　ｍＬ　１．２０　ｇ／Ｌ的茶多酚溶液，最后加入２．０　ｍＬ多巴胺溶液，定容，　恒温２　ｍｉｎ，在４７５　ｎｍ处测定吸光度，按照１．２．２的方法计算抑制率．不同浓度的茶多酚对酪氨酸酶活性的　

抑制作用如图３所示，结果表明随着茶多酚浓度的增大，对酪氨酸酶活性的抑制作用增强，当茶多酚的质量　

浓度达到０．２０　ｇ／Ｌ时，对酪氨酸酶的抑制率达到６２．２０　．抑制率达到５Ｏ　的茶多酚质量浓度（ＩＣ　。）为　

０．１１３　０　ｇ／Ｌ．与对照品Ｖｃ相比茶多酚对酪氨酸酶也具有较好的抑制效果，将成为一种新型功能性化妆品添　加剂应用于美白化妆品中．　

２．２．３金银花叶子总黄酮提取物对酪氨酸酶的抑制　

３５。Ｃ恒温条件下，向１０　ｍＬ比色管中加入２．０　ｍＬ酪氨酸酶溶液，３．５　ｍＬ磷酸盐缓冲液，再分别加入　

０．５、０．７、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０　ｍＬ　４．００　ｇ／Ｌ金银花叶子总黄酮提取物溶液，最后加入２．０　ｍＬ多巴胺溶　液，定容，恒温２　ｍｉｎ，在４７５　ｎｍ处测定吸光度，按照１．２．２的方法计算抑制率．不同浓度的金银花叶子总黄　

酮提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用如图４所示，随着总黄酮提取物浓度增大，抑制率增大，当总黄酮提取　物的质量浓度达Ｎｏ．６　ｇ／Ｌ后，抑制率几乎保持不变，与对照品Ｖｃ相比金银花叶子总黄酮提取物对酪氨酸　

酶活性具有一定的抑制作用，据文献报道［１　金银花叶子提取物既具有抑菌效果又有一定的抗羟基自由基作　

用，因此，将金银花叶子提取物与其他美白剂联合使用将会在美白、抗衰老化妆品领域有一定的应用前景．　

２．２．４　丹皮酚对酪氨酸酶的抑制　

３５。Ｃ恒温条件下，向１Ｏ　ｍＬ比色管中加入２．０　ｍＬ酪氨酸酶溶液，３．５　ｍＬ磷酸盐缓冲液，再分别加入　０．３、０．５、０．７、０．９、１．１、１．３、１．５、１．７、２．０　ｍＬ　１．０６　ｇ／Ｌ丹皮酚溶液，最后加入２．０　ｍＬ多巴胺溶液，定容，恒　

温２　ｍｉｎ，在４７５　ｎｍ处测定吸光度，按照１．２．２的方法计算抑制率．不同浓度的丹皮酚对酪氨酸酶活性的抑　

制作用如图５所示，当丹皮酚的质量浓度达到０．１４　ｍｇ／Ｌ时，抑制率达到４４．５０　，随着丹皮酚浓度增加抑