收稿日期:2007-10-17;修回日期:2007-12-18基金项目:中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(中国农业科学院草原研究所)资助项目作者简介:任卫波(1979-),男,山西晋城人,助理研究员,博士,2007年毕业于中国农业大学草业科学系,从事牧草种质资源与育种,已发表论文10余篇󰀁

文章编号:1673-5021(2008)02-0104-05紫花苜蓿耐寒越冬性研究进展

任卫波1,陈立波1,郭慧琴2,徐󰀁柱1,解继红1(1󰀁中国农科院草原所,内蒙古󰀁呼和浩特󰀁010010;2󰀁内蒙古农业大学,内蒙古󰀁呼和浩特󰀁010018)摘要:从形态结构、生理生化、基因表达3个层次对苜蓿耐寒及其越冬性相关研究进展进行简要回顾,对提高苜蓿越冬能力的具体措施进行了总结,讨论了当前研究的不足,并对未来的研究热点进行了展望。关键词:紫花苜蓿;耐寒;越冬中图分类号:S541󰀁󰀁󰀁文献标识码:A

󰀁󰀁紫花苜蓿(MedicagosativaL󰀁)是重要的多年生豆科牧草之一,因其具有较高的生态价值和经济价值,被冠以󰀁牧草之王󰀁的美誉。在高纬度寒冷地区,低温、干旱等逆境胁迫导致苜蓿减产,甚至不能安全越冬,从而影响苜蓿的分布和生产。因此,开展苜蓿抗寒相关研究、提高苜蓿安全越冬能力,是紫花苜蓿研究的热点问题之一。1󰀁寒害与冷害及其与越冬性的关系冷害是指当温度低于12󰀁而高于0󰀁时,植物因低温而产生的直接损伤乃至致死;寒害是指温度低于0󰀁时,植物细胞因结冰等因素造成间接损伤乃至致死。对低温胁迫的响应分为三类:(1)冷敏感性:当温度低于12󰀁时,植株就受到损伤;(2)耐冷敏寒性:植株能在12󰀁下积累抗性,但不能在0󰀁以下存活;(3)耐寒性:植株能在0󰀁以下存活。冷害与寒害的损伤机理有本质的区别。冷害损伤主要是直接由低温造成的,寒害损伤主要是由于细胞内结冰导致的间接损伤[1]。影响苜蓿越冬能力的因素主要包括:当年的秋冬季的环境胁迫(包括冷害、寒害、干燥、因冰封导致根部严重缺氧等)和来年春季返青的环境胁迫(包括干旱、气温剧变造成的冷害等)。这些胁迫的组成与程度因地点与年度而异。苜蓿越冬性研究就是为了将冻害和寒害的影响降低到最低限度,提高苜蓿越冬成活率和产量。2󰀁苜蓿对冬季逆境胁迫的适应2󰀁1󰀁逆境胁迫对苜蓿植株形态结构的影响及其适应2󰀁1󰀁1󰀁叶叶片形态结构与苜蓿植株的抗寒性有一定关系。其中叶宽长比小即叶片窄长、气孔密度大、叶片组织密度大、疏松度小、叶脉突起度大的植株比较抗寒[2]。叶片的解剖结构在低温下也发生变化,Jan-icke等(1989)研究发现随着温度的降低,苜蓿叶片气孔导度下降。关于叶形与耐寒性还有一定争议[3]。Campbell等(1991)在对二倍体苜蓿研究中发现,叶形与苜蓿耐寒性不存在相关性[4]。2󰀁1󰀁2󰀁根苜蓿根系具有四种类型:直根型、分枝型、根茎型和根蘖型。分枝型和根茎型根的苜蓿具有更新能力,当母株主根冻死后,还可产生新的根,因此比单主根具有更强的耐寒能力[5,6]。根蘖型苜蓿具有大量的水平侧根,因此抗寒越冬能力强于直根型苜蓿。但是,关于根蘖型苜蓿与直根型苜蓿耐寒性差异仍有争议。根蘖型苜蓿在有些区域的耐寒性与直根型苜蓿没有显著差异[7]。除此之外,根茎和根越粗,苜蓿耐寒性越强[8]。2󰀁2󰀁逆境胁迫对苜蓿生理生化活动的影响及其适应2󰀁2󰀁1󰀁生化水平2󰀁2󰀁1󰀁1󰀁超氧化物歧化酶当苜蓿植株受到低温胁迫时,活性氧分子在细胞内大量累积。过多的活性氧分子会使膜脂过氧化、脱脂化、磷脂游离、细胞膜结构破坏,最终导致细胞功能的丧失。SOD、POD等同工酶能够抑制过氧

󰀁104󰀁

第30卷󰀁第2期󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁中󰀁国󰀁草󰀁地󰀁学󰀁报󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁2008年3月󰀁󰀁Vol󰀁30󰀁No󰀁2󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁ChineseJournalofGrassland󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁Mar󰀁2008󰀁󰀁化,减轻活性氧的伤害。研究表明,当温度降低时,苜蓿植株叶片的Cu,Zn-SOD酶活性呈先升高后降低的趋势。这说明在低温胁迫初期,SOD活性增加,通过消除冷胁迫产生的活性氧和氧自由基,对幼苗进行保护;当植株经过抗寒锻炼,获得耐寒能力后,SOD酶活性逐渐下降。在抗寒锻炼过程中起保护作用[9]。2󰀁2󰀁1󰀁2󰀁储藏蛋白从9月初到10月中旬,根储藏蛋白(Vegetativestorageproteins)的浓度和总量显著增加,此后伴随着编码VSPs的转录子的消失,VSPs的含量基本保持不变,其它的可溶性蛋白则持续增加直到秋末冬初,占到根储藏蛋白总量的60%[10]。苜蓿秋天过早的落叶降低了VSPs的累积。这些化合物的含量如脯氨酸、精氨酸、组氨酸和根储藏蛋白与来年苜蓿春季返青生长有显著的正相关,但是与越冬率没有显著关联。苜蓿越冬率主要与根内保护性糖含量呈显著正相关[10]。Ferullo等(1997)研究发现,苜蓿抗寒性差可能是因缺乏富含甘氨酸的蛋白质如MSA-CIA和MSACIB在细胞内的累积造成的[11]。2󰀁2󰀁1󰀁3󰀁根内可溶性糖苜蓿根及根颈中可溶性糖的积累(尤其是低聚糖)与其抗寒及越冬性有着显著的正相关[12,13]。冬季冰封造成苜蓿根部高度缺氧,这些缺氧环境降低了苜蓿根内可溶性糖(蔗醣、果糖、葡萄糖和果聚糖)的累积,降低了3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性,从而影响了越冬和来年春季返青[14]。2󰀁2󰀁1󰀁4󰀁脱落酸(ABA)单一使用ABA胁迫可以在一定程度上提高耐寒性,但是要最大限度提高耐寒性,必须进行冷适应性诱导。ABA处理会导致蛋白合成模式改变,部分改变与冷适应诱导相一致,冷适应诱导是ABA独有的[15]。2󰀁2󰀁1󰀁5󰀁脯氨酸在低温胁迫下,肇东苜蓿植株体内游离脯氨酸含量积累,并随着低温处理时间的延长而增加[16]。2󰀁2󰀁2󰀁生理水平2󰀁2󰀁2󰀁1󰀁钙离子的流动当温度从25󰀁降到15󰀁时,细胞内的钙离子浓度没有显著变化。当温度进一步从15󰀁降低时,钙离子流入开始显著。当温度降低到4󰀁时,钙离子的流入是25󰀁时的15倍。添加钙螯合剂,抑制细胞外的钙离子流入胞质,同时也抑制了冷诱导基因CAS(Cold-acclimation-specific)的表达。反之,添加钙离子载体将促进胞外钙离子的流动,加强CAS基因的表达。进一步分析表明,在4󰀁低温下细胞骨架结构发生重组,细胞膜脂成分发生变化,不饱和脂肪酸含量增加,胞膜的流动性降低,透性增强,Ca离子流入细胞质内,传递冷胁迫信息,导致低温响应基因Cas30的表达[17]。设想的冷胁迫响应过程:温度降低到15󰀁以下󰀁细胞膜流动性降低󰀁细胞膜钙离子通道激活󰀁细胞壁钙离子流入胞质󰀁冷响应蛋白激酶磷酸化酶激活󰀁冷响应蛋白磷酸化󰀁冷响应基因表达增强󰀁抗寒能力增加[18,19]。国

内也有类似的报道。用50mmol/L的CaCl2浸泡图牧吉和公农1号苜蓿种子,处理后两个品种幼苗的抗寒性都显著提高,进一步分析表明,两个品种的苜蓿植株的SOD、POD等酶活性及脯氨酸含量也提高[20]。2󰀁2󰀁2󰀁2󰀁光合作用在低温下,苜蓿叶片的最大净光合速率和叶绿素含量均降低,而且光照大于黑暗,其原因可能是低温下光照加剧叶绿素的降解和细胞膜系统的损伤,从而加剧光合电子传递的抑制和光合速率的降低[21]。2󰀁3󰀁逆境胁迫对苜蓿基因表达的影响及其适应2󰀁3󰀁1󰀁cDNA筛选为了寻找与冷胁迫响应相关的基因,研究它们在冷胁迫条件下在不同基因型的紫花苜蓿中的表达情况,Ivashuta等(2002)对1036个cDNA克隆进行了筛选。通过筛选,获得在耐寒和不耐寒苜蓿品种中表达显著差异的cDNA。这些差异表达cDNA是一些携带有长末端重复序列(LTR)的非编码重复因子[22]。进一步分析表明,这些cDNA可能代表某个假想的反转录转座子家族,这些转座子在低温诱导下可以激活表达;可是,这些转座子的激活并不依赖基因型[22]。Mohapatra等(1989)以黄花苜蓿耐寒品种Anik的幼苗为材料,构建其cDNA文库,对冷胁迫特异诱导表达基因进行了筛选。结果发现,3个cDNA克隆pSM784,pSM2201和pSM2358的转录表达水平仅与苜蓿植株耐寒性呈显著正相关,即抗寒性越强转录表达水平越高[23]。2󰀁3󰀁2󰀁冷诱导基因随着秋季落叶,冷诱导基因msaCIA(编码一种富含甘氨酸蛋白)转录水平在不耐寒苜蓿品种󰀁WL225󰀁显著降低,但是在耐寒品种󰀁ACCaribou󰀁󰀁105󰀁

任卫波󰀁陈立波󰀁郭慧琴󰀁徐󰀁柱󰀁解继红󰀁󰀁紫花苜蓿耐寒越冬性研究进展中其转录水平没有显著变化[24]。寒冷、脱落酸和干旱胁迫都可以显著提高转录因子基因WXP1的表达水平。WXP1的高度表达可以提高转基因紫花苜蓿叶片表皮蜡质物的累积,转基因苜蓿叶表皮蜡质物增加29󰀁6%~37󰀁7%,叶片蜡质物的增加,降低了水分和叶绿素的损失,从而提高了抗旱耐寒能力[25]。冷诱导基因CAS15编码14󰀁5KD的蛋白,有4个包含由10个氨基酸组成的结构域[24]。3󰀁提高苜蓿越冬能力的对策3󰀁1󰀁栽培管理措施播种期、冬春季管理措施和刈割制度都对苜蓿的安全越冬有显著影响[26]。播种期越早,苜蓿根颈越粗,入土越深,因此适当提前播种有利于提高苜蓿越冬能力。施种肥、延长生长期促进幼苗生长,加强冬春季田间管理如增加根颈保温层,增加土壤含水量等措施,可有效提高苜蓿越冬率[27]。最后一次刈割时间对苜蓿越冬性影响较大,一般认为应在霜冻前4~6周进行,这样有利于根茎内碳水化合物的累积[27]。3󰀁2󰀁常规育种国外苜蓿抗寒常规育种的研究主要集中在苜蓿秋眠性方面。秋眠性是指随着秋季日照时数的减少而引发的生理休眠,具体表现为秋季苜蓿再生能力的降低。研究发现,苜蓿的秋眠性与其冬季逆境损伤呈显著负相关。秋眠性品种秋季再生株高度低,但抗寒能力强,冬季损伤低;非秋眠品种秋季再生株高度高,但抗寒能力弱,冬季损伤重。通过连续选择,可以显著提高非秋眠品中的耐寒性[28]。利用田间选择、回交、种间或属间杂交,经过多代选择,我国也先后育成了草原1号、草原2号、龙牧801、龙牧803等耐寒品种。虽然常规育种取得了很大的成就,但育种周期长,受环境影响较大,不能完全满足苜蓿生产的需要。3󰀁3󰀁基因工程由于紫花苜蓿已经建立了较好的体细胞胚再生组培体系,使得利用根癌农杆菌(Agrobacteriumtu-mefaciens)对其进行转化非常方便快捷[29]。尽管如此,由于苜蓿越冬受低温、冰冻、缺氧等多个生理胁迫过程的影响,而且控制这些生理过程的基因非常多,因此通过基因操作技术来提高苜蓿越冬能力仍然是很困难的。为了解决这一问题,在转基因苜蓿候选基因的选择上,并没有选择那些与单一过程有关的基因,而是选择了这些胁迫因素的公共效应。研究发现,与越冬性相关的这些胁迫对植物的影响有相似之处:(1)活性氧分子的增加;(2)细胞膜的脂肪酸含量增加与蛋白质的降解;(3)细胞膜结构损伤;(4)细胞质的大量流失与细胞活性的丧失。基于此,如果提高植株的抗氧化能力,苜蓿的冬季损伤会显著降低。将拟南芥的Fe-SOD[30],烟草中的Mn-SOD[31,32]基因转入紫花苜蓿植株体内,转基因苜蓿植株体内两种酶的活性显著增强,同时其越冬存活率平均比对照高出25%,但是该酶的增强表达并没有有效的降低低温对植株造成的直接伤害(如对叶片和须根)[30],可能是Fe-SOD的高度表达减轻了由冻害引起的次级损伤,从而间接加强了苜蓿的越冬能力[30]。