79喹乙醇在大鼠肝微粒体中代谢产物的分离和鉴定 刘兆颖，陈冬梅，袁宗辉 华中农业大学国家兽药残留基准实验室 喹乙醇（olaquindox），又名倍育诺、喹酰胺醇，属于喹噁啉类药物，能促进动物生长，提高饲料转化率，具有广谱抗菌作用，可以预防猪的大肠杆菌和痢疾。但由喹乙醇具有生殖毒性、致突变性和光毒性，因被禁止或限制使用。 目前国内外对喹乙醇的代谢研究很少，Spierenbur等（1988）用HPLC检出了猪胃肠道中喹乙醇的三种还原代谢物，即N1-还原喹乙醇、N4-还原喹乙醇、脱二氧喹乙醇。JECFA报道猪口服喹乙醇(2mg/kg b.w)后，24h内就消除了药量的90%，其中70%是以原形从尿液中排出，血浆最大浓度出现时间是1-2h，表明喹乙醇吸收快，消除也快。给药2天后，检测组织中的放射性，发现肝脏和肾脏分别残留52和110μg/kg，肌肉为9μg/kg，。尿液中存在N1-还原喹乙醇、N4-还原喹乙醇、脱二氧喹乙醇和三种羧酸衍生物，其中3-甲基-喹噁啉-2-羧酸（MQCA）在体内消除缓慢，因而被规定为肝肾组织的残留标识物。因此为了更好地了解喹乙醇的代谢特征，本文先用体外代谢方法对其代谢进行研究。 肝微粒体法是由制备的肝微粒体辅以氧化还原型辅酶，在模拟生理温度及生理环境条件下进行生化反应的体系。制备肝微粒体一般用差速离心法。肝微粒体体外温孵法与其他的体外肝代谢方法相比，其酶制备技术简单，代谢过程快，结果重现性好，易大量操作，便于积累代谢样品供结构研究；同时，该方法可用于对药酶的抑制及体外代谢清除等方面的研究，因而在实际工作中应用较为普及。本文就用大鼠肝微粒体来研究喹乙醇的体外代谢，对其代谢产物的鉴定就用高灵敏度、高质量精度和多级质谱的LCMS-IT-TOF联用技术，首次发现了一些没报道的新代谢产物，完善了喹乙醇的代谢途径，为喹乙醇的毒性研究和残留监控提供了重要的指导意义；同时，为喹噁啉类其它药物的代谢研究提供了重要的参考价值。 1. 实验材料 1.1 标准品及标准溶液配制 喹乙醇，含量99.8%，中国兽医药品检查所，批号H050204； 喹乙醇储备液：准确称取26.3mg喹乙醇于10mL容量瓶中，用少量超纯水溶解，再用甲醇定容使之成为10mmol/L的储备液，4℃冰箱避光保存； 脱二氧喹乙醇，含量98%以上，华中农业大学兽药研究所合成，批号20050831； 脱二氧喹乙醇标准储备液：准确称取23.2mg喹乙醇于10mL容量瓶中，用甲醇定容使之成为10mmol/L的储备液，4℃冰箱避光保存。 1.2 试验动物 7周龄Whister雄性大鼠，体重167g-185g，购自湖北疾病预防控制中心实验动物房。实验前禁食12h，期间自由饮水。 1.3 试验仪器和设备 电子天平，感量0.000001g，日本SHIMADZU公司； 隔水式电热恒温培养箱，303AS-3型，上海浦东荣丰科学仪器有限公司； 80日立CS120GLS超速冷冻离心机； HITACHI HIMAC CR 21G高速冷冻离心机； Agilent 8453E 紫外可见光谱仪； 意大利Angelantoxi Polar 530超低温冰箱； 美国Millipore-Q超纯水仪； 日本LCMS-IT-TOF，配SPD-M20A二极管阵列检测器、LC-20AD 泵、DGU-20A3自动脱气装置、SIL-20AC自动进样器和CTO-20AC柱温箱，LCMS solution Chemstation 工作站。 1.4 试剂及溶液配制 乙腈，色谱纯，Fisher，批号 064510； 甲酸，分析纯，上海试剂一厂，批号20060403； 氯化镁，分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司，批号F20060714； 蔗糖，Amresco，批号，3073B95； 低亚硫酸钠，化学纯，国药集团化学试剂有限公司，批号F20060815； 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸钠（NADP+）Roche，批号2006828； 6-磷酸葡萄糖（glucose 6-phosphate G-6-P），含量98-100%，批号G7250； 6-磷酸葡萄糖脱氢酶（glucose 6-phosphate dehydrogenase G-6-PD），Sigma，含量2000国际单位（U），批号，G8404； 三羟甲基氨基甲烷（Tris Base），Amresco，批号2005616； 乙二胺四乙酸（EDTA），分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司，批号W20051216； 氯化钾，中国医药集团上海化学试剂公司，批号，F041015； 三氯乙酸，含量99%，上海宏瑞化工有限公司，批号20061102； BCA蛋白测定试剂盒，美国Pierce公司，货号，23225； Tris-HCl溶液：准确称取30.285mg Tris于500mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容，盐酸调pH值，使成为0.5mmol/L的pH7.4 Tris-HCl缓冲液； Tris-HCl匀浆缓冲溶液：准确称取30.285mg Tris、146.125mg EDTA和42.75mg蔗糖，于500mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容至500mL，盐酸调pH值，使成为0.5mmol/L的pH7.4 Tris-HCl（含1mmol/L EDTA、0.25mmol/L蔗糖）匀浆缓冲液，置于4℃保存。 注：以上溶液试验时均在有效期内 2. 实验方法 2.1 肝微粒体的制备 用差速离心法制备大鼠肝微粒体。大鼠（n＝3） 禁食过夜，脱臼处死后迅速剖开其胸腔和腹腔，取出肝，用Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4）反复冲洗除掉组织中的血液成份，称重，按1:4（W/V）加入0.05mol/L pH 7.4 Tris-HCl缓冲溶液（含0.15mol/L KCl、1mmol/L EDTA、0.25mol/L蔗糖），用玻璃匀浆器制成肝匀浆。将制备好的肝匀浆在Hitachi micro 120GX超速冷冻离心机上10000g离心20min。取上清液100000g离心60min，上清液即为胞液，淡红色沉淀即肝微粒体。取部分微粒体蛋白以pH7.4 0.1mol/L Tris-HCl稀释，用于测定蛋白含量，其余用Tris-HCl缓冲溶液分装，放入-80℃冰箱中储存备用。以上所有操作均在冰浴中进行。 812.1.1微粒体蛋白浓度测定 用BCA法（Smith et al, 1985）测定蛋白浓度，具体操作如下：1）标准曲线绘制：按表1配成不同浓度的牛血清蛋白（BSA）溶液。取9只干净的试管，以英文字母A-I编号，分别在每管里加2mLBCA工作液，分别加入不同浓度的BSA溶液0.1mL混匀，放到37℃水浴锅里反应30min，冷却到室温，用Agilent 8453紫外分光光度计在562nm处进行比色测定光密度值（OD），以I号为空白，所有样品在10min内测完，每一样品重复一次，取平均值。以减去空白的OD值为纵坐标（y），BSA浓度为横坐标（x）绘标准曲线图。算出回归方程和相关系数。2）肝微粒体蛋白含量的测定：取2支试管，各加入微粒体悬液0.1mL，再加BCA工作液2mL，以后操作同上。将微粒体悬液样品的OD值减出空白管I的OD值，代入回归方程，求出相应蛋白溶液的浓度。 表1 BSA的标准溶液 Table1 Standard solution of BSA 编号 稀释液的体积a（μL） 2mg/mL的BSA体积（μL）最终的BSA浓度（μg/mL） A 0 取标准蛋白300 2000 B 125 取标准蛋白375 1500 C 325 取标准蛋白325 1000 D 175 从B号中取175 750 E 325 从C号中取325 500 F 325 从E号中取325 250 G 325 从F号中取325 125 H 400 从G号中取100 25 I 400 0 0＝空白 a） 稀释液与样品的稀释液相同，都为0.05mol/L Tris-HCl（pH7.4）缓冲液（含0.001mol/L EDTA） 2.1.2细胞色素P450差示光谱及含量测定 取10mg/mL的肝微粒体悬液0.3mL，加0.10mol/L pH7.4的PBS 5.7mL混合，取3mL装于比色杯内，向比色杯内加4~5mg连二亚硫酸钠，用小玻棒小心混匀，待稳定后，置于Agilent8453紫外分光光度计，扫描400~500nm间的基线。然后向样品杯中轻轻充入CO，约60秒后再扫描400~500nm的差示光谱，根据450nm和490nm处吸光度OD值，计算细胞色素P450含量。计算公式如下： ()()()mL/mg911000nm490nm450ODmg/nmol450P反应体系中的蛋白浓度××−= 2.2 喹乙醇与NADPH生成系统孵育 微粒体1mg和NADPH-生成系统（5mM MgCl2，10mM 6-磷酸葡萄糖，2mM NADP，2μ/mL 6-磷酸葡萄糖脱氢酶）在0.05M Tris-HCl缓冲液中预反应2min，加50μM喹乙醇开始反应120min，反应总体积0.5mL。反应后用100μL的15% 三氯乙酸（TCA）终止，12000rpm离心10min，取50μL上清液进样。为了研究喹乙醇的代谢物是否能进一步代谢成别的化合物，用50μM脱二氧喹乙醇与微粒体孵育，其孵育条件与喹乙醇一样，终止的处理方法同喹乙醇。 822.3 LCMS-IT-TOF条件 仪器用Shimadzu LCMS-IT-TOF，LC包括SPD-M20A二极管阵列检测器、LC-20AD 泵、DGU-20A3自动脱气装置、SIL-20AC自动进样器和CTO-20AC柱温箱。分析柱为VP-ODS (5μm，150×2.0mm)。扫描范围200-400nm，柱温40℃，流速为0.2mL/min，流动相A，乙腈：水：甲酸 5：95：0.1 (v/v)；流动相B，乙腈：水：甲酸 80：20：0.1 (v/v)：。采用梯度洗脱：0-5min，2-5%B；5-15min，5-30%B；15-18min，30-100%B；18min-23min，100%B；23.1min，2%；23.1-30min，2%。 质谱条件：离子化用ESI ，正离子模式，扫描范围m/z 50- 500，接口电压4.5KV，检测电压1.6KV，液氮为雾化气，流速1.5L/min，液氮也作为冷却气，压力170KPa，CDL和加热模块的温度都为200℃，高纯Ar作为碰撞气，相对碰撞能量和压力都为50%，离子累积时间为20msec。仪器控制、数据采集和处理用LCMSsolution3.1软件操作。 所有离子的分子量都采用单同位素荷质比计算，LCMSsolution配有分子预测软件，一个荷质比能计算出很多的分子式，由于时间飞行质谱具有很高的质量精度，因此，在计算可能的分子式时，把质量误差的范围设置在±5mDa以内。把碎片之间的断裂的值也设置在±5mDa以内，这样就能准确的找到其代谢物和推倒每个化合物的裂解途径。 3. 结果 3.1肝微粒体组成特点 3.1.1肝微粒体的蛋白浓度测定 用BCA法测定蛋白浓度，按表2数据绘制标准曲线。以蛋白浓度C为横坐标（X），吸光度OD值为纵坐标（Y），所得标准曲线为：Y=0.0011X+0.0646，r=0.9954。根据上述方程及公式计算出：大鼠肝微粒体的蛋白浓度为24mg/mL。 表2 BCA法测定的标准蛋白浓度的吸光值 Table2 Determination the absorbance of standard protein concentrations by BCA Kit 标准BSA蛋白浓度（μ/mL） 562nm BSA的吸光值（OD） 25 0.02 125 0.18 250 0.37 500 0.65 750 0.99 1000 1.24 1500 1.76 2000 2.14 3.1.2微粒体细胞色素P450酶CO差示光谱 图1为细胞细胞色素P450通入CO后的差示光谱，由图中可以看出大鼠肝微粒体P450经连二亚硫酸钠还原与CO结合后在450nm处有最大吸收，并且420nm处无吸收，说明微粒体P450酶活性很高，没有失活，可以用于代谢研究。