作者简介胡晓苗（１９７１－），男，安徽望江人，在读硕士，助理研究员，从事兽医研究。收稿日期２００６!０４!１３由于高免卵黄抗体自身的一些缺陷，近年来在全国大部分地区禁止使用高免卵黄抗体。其缺陷是：①卵黄抗体往往由商品蛋所制作，带由鸡霉形体、禽白血病、鸡白痢、鸡传贫、沙门氏菌等多种病原体，这些病原体可经卵黄液的使用而垂直传播，从而引起相应的疾病。即使卵黄液中加入一定的防腐剂和抗生素，但对病毒无效［１，２］。另外，蛋黄中含有大量分子量很大的卵黄磷蛋白及脂肪等物质，注入肌肉难以吸收而造成局部肿胀、坏死、过敏反应［２］。②常规卵黄抗体经稀释分装而成，体积大，运输不便。另外，需低温保存和运输，由于反复冻融和运输不当而造成效价降低。因此，笔者进行了卵黄体抗体的提纯和提纯液的冻干研究，旨在克服卵黄抗体的缺陷。１卵黄抗体的提纯１．１材料与方法１．１．１材料。聚乙二醇（ＰＥＧ６０００，进口分装，购自合肥大药房）；高免鸡蛋（测其效价为１∶１２８）；法氏囊标准抗原及阳性血清（购自哈兽研）；琼脂糖粉（浙江某生物化工厂）。１．１．２方法。（１）提纯用高免卵黄液的制备。将收集的高免蛋浸泡消毒，无菌分离蛋黄，经无菌搅碎机搅拌５ｍｉｎ，按１∶１加入无菌生理盐水，用双层无菌纱布过滤，加入青霉素、链霉素各１０００单位、叠氮钠至０．０１％浓度，置４℃冰箱备用。（２）１％琼脂糖平板：称取琼脂糖１ｇ，溶于１００ｍｌ生理盐水中，加热融化，然后乘热倒入平皿中，冷却后放入冰箱备用。（３）ＰＢＳ缓冲液［３］。ＫＨ２ＰＯ４１３．６ｇ、ＮａＣｌ５８．４ｇ、ＮａＣＮ３１．０ｇ，用９８００ｍｌ蒸馏水溶解，装入１万ｍｌ血清瓶，用１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ调至ｐＨ值７．５（大约用１００ｍｌ），定容至刻度处，高压灭菌后备用。（４）卵黄液中免疫球蛋白ＩｇＧ的提取［４］。在高免卵黄液中加入４倍体积的ＰＢＳ缓冲液，充分摇匀，再加入ＰＥＧ６０００，使其最终浓度达４％，搅拌１０ｍｉｎ后，４０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ。无菌收集上清液再加入ＰＥＧ６０００，使其最终浓度为１２％，搅拌１０ｍｉｎ，同上离心，弃上清液，所得产品即为粗提的ＩｇＧ。１．２结果与分析１．２．１ＩｇＧ效价。琼脂扩散法：将提纯的抗体稀释致原卵黄液体积，用事先准备的琼脂糖平板，放在事先画好的７孔图案上，打孔，加入标准抗原和ＩｇＧ稀释液。将平板放在湿盒中，置３７℃温箱中２４～４８ｈ观察，结果为平均效价１２８。说明用此法提取ＩｇＧ时能充分提取，即效价不变。１．２．２ＩｇＧ稀释液检验。（１）细菌学检验。将ＩｇＧ稀释液接种于营养琼脂试管斜面上，３７℃鸡胚培养２４ｈ，观察到无细菌生长。（２）病毒学检验。将９日龄ＳＰＦ鸡胚（购自山东家禽研究所）１０枚，分为２组，ＩｇＧ稀释液接种１组，０．２ｍｌ／枚；另一组作对照，接种生理盐水，３７℃鸡胚孵化５ｄ后通过照蛋，可以看出血管清晰，说明２组鸡胚均生长良好。将鸡胚放入４℃冰箱过夜，第２天观察鸡胚，２组均未发现病变。通过检验说明，用提纯卵黄抗体的方法，避免了细菌和病毒的垂直传播，而且排除了卵膦子等大分子物质的应激反应。２卵黄抗体提取液的冻干液体状的卵黄抗体在保存和运输上存在着体积大易失活等缺点，而冷冻干燥技术能使纯化的抗体在预先冷冻的状态下，不经液态直接升华除去水分而获得干粉型制剂，它避免了液态下保存的抗体易失活易变形的缺点，使产品体积大大缩小，便于运输及能够长时间保存［５］。２．１材料和方法２．１．１材料。ＩｇＧ稀释液，冷冻真空干燥机（安徽省农科院畜牧兽医研究所兽药制剂室），蔗糖，真空枪。２．１．２方法。在ＩｇＧ稀释液中加入浓度５％蔗糖作为冻干干燥剂，经定量分装机分装２ｍｌ于７ｍｌ西林瓶内，放入冷冻真空干燥机中制成冻干制剂。用真空枪检验，如果呈现蓝色荧光，表明瓶内处于真空保存状态，为合格产品。２．２结果与分析２．２．１安全性检验。取３０日龄健康鸡（河南故始三高集团提供）２０只，分为２组，一组肌注冻干稀释液（１∶４倍稀释，即每瓶加生理盐水８ｍｌ，稀释后效价为１∶３２）２ｍｌ，另一组肌注４ｍｌ，观察１０ｄ。结果２组精神状态一直良好，临床未见异常表现，剖检未见病变，说明ＩｇＧ冻干制剂使用安全。２．２．２抗体冻干前后的效价测定。琼脂扩散法测定效价变化情况：抽查２个批组，每批随机抽取１０瓶，测定结果都为１∶１２８，说明制成冻干制剂对效价无影响。２．２．３温度对抗体效价的影响。将常规未提纯卵黄抗体液和ＩｇＧ冻干制剂于不同温度下作用一定时间后，用琼脂扩散法测定效价变化情况，结果见表１。（下转第２１５０页）高免卵黄抗体提纯及提取液冻干的研究

胡晓苗１，２，李春芬２，汪丽１，赵磊２（１．安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，安徽合肥２３００３１；２．安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥２３００３６）

摘要针对高免卵黄抗体的缺陷，采用聚乙二醇法提纯卵黄抗体ＩｇＧ，ＩｇＧ稀释为原卵黄液体积时效价不变，为１∶１２８，细菌和病毒学检验均为阴性。将ＩｇＧ稀释液制成冻干制剂，实验表明冻干后效价不变且对温度的抵抗力大大提高，冻干制剂防治效果良好。说明此种方法可避免常规卵黄抗体临床传播疫病的危险，运输和保存更加方便，真正做到了安全、高效。关键词卵黄抗体；提纯；ＩｇＧ；冻干；琼脂扩散法中图分类号Ｑ９５９．９文献标识码Ａ文章编号０５１７－６６１１（２００６）１０－２１４７－０１安徽农业科学，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｈｕｉＡｇｒｉ．Ｓｃｉ．２００６，３４（１０）：２１４７，２１５０责任编辑曹淑华责任校对曹淑华

表１温度和时间对２种不同剂型抗体效价的影响卵黄抗体液ＩｇＧ冻干制剂００１批００２批００３批００１批００２批００３批６０℃１ｈ－±±－－－３７℃３０ｄ＋＋＋＋＋＋＋＋＋±－－０～４℃琼脂糖１年＋＋＋＋＋＋＋＋＋－－－－２０℃１年－－－－－－注：“－”为无影响，“±”为稍有影响，“＋”为影响较小，“＋＋＋”为完全失活。从表１可以看出，纯化的卵黄抗体冻干后对温度的耐受力大大增强，在４℃可保存１年以上，室温下可保存１个月以上。２．２．４防治实验。取１月龄易感病鸡（经琼脂扩散法监测为阴性）５０只随机分成５组，每组１０只，隔离饲养。每组处理及对鸡病的免疫效果见表２。从表２可以看出，卵黄冻干制剂预防保护率为１００％，紧急接种和治疗时保护率９０～８０％。笔者在合肥郊县进行现场使用观察，结果相似。３结论与讨论（１）通过纯化提取卵黄抗体ＩｇＧ，可彻底消除垂直传播疫病的危险性，同时可免除卵磷蛋白等大分子物质的副作用。（２）提纯ＩｇＧ稀释液制成冻干制剂，其效价不变，对温度的耐受力大大增强；由于冷冻干燥在低温高真空度下进行，不会改变产品中活性分子结构，产品不起泡不暴沸，且不粘壁易溶于水［６］。所有这些为长期于室温或普通冰箱内保存提供了依据。（３）不足之处：生产所需化学试剂量大，操作程序复杂，需要添置离心和冻干设备，由此构成的销售价格比常规卵黄抗体高。尽管如此，笔者认为这是发挥卵黄抗体作用的一条途径。参考文献［１］张家峥，施萍，牛桂玲．使用高免卵黄抗体液利弊及前景［Ｊ］．中国家禽，２００３，２５（２３）：４５．［２］温建新，沈敏，钟发刚．抗传染性法氏囊病高免卵黄抗体的使用［Ｊ］．中国兽医杂志，１９９９，２５（３）：２８．［３］李成文．现代免疫化学技术［Ｍ］．上海：科学技术出版社，１９９０：２６３－２６６．［４］易序权，黎杰红，魏爱兰．聚仪二醇提取卵黄ＩｇＧ的研究［Ｊ］．中国畜禽传染病

，１９８９（２）：４９－５１．［５］王世中．免疫化学技术［Ｍ］．北京：科学出版社，１９８０：１９４－１９６．［６］陆萍，倪学英，胡贵贤．抗鸡传染性法氏囊病毒单克隆抗体冻干制剂的制备效检与应用［Ｊ］．上海农学院学报，１９９４，１２（２）：１００－１０３．处理实验鸡数发病鸡数死亡鸡数保护率％攻毒前２４ｈ注射冻干稀释液１ｍｌ１０００１００攻毒同时注射冻干稀释液１ｍｌ１０２１９０攻毒后２４ｈ注射冻干稀释液１ｍｌ１０５２８０肌注生理盐水１ｍｌ１０１０８不攻毒不注射组１０００表２卵黄抗体提取液对鸡病的免疫效果组与对照组差异显著（Ｐ＜０．０５）。这表明４０ｇ／ｄ的植物脂肪粉可能不太合适；添加４０ｇ／ｄ的过瘤胃脂肪有提高脂肪消化率的作用。４结论在绵羊日粮中添加４０ｇ／ｄ脂肪酸钙和植物脂肪粉对瘤胃液氨态氮浓度有一定的降低作用，但试验组与对照组以及试验组与试验组之间在０．０５水平上无差异；４０ｇ／ｄ的过瘤胃脂肪添加水平有降低瘤胃ｐＨ值的作用，但作用并不显著；绵羊添加４０ｇ／ｄ的脂肪酸钙提升了干物质采食量，而添加４０ｇ／ｄ的植物脂肪粉和硬脂肪却降低干物质采食量，但过瘤胃脂肪对采食量的影响并不显著。添加４０ｇ／ｄ过瘤胃脂肪对营养物质全消化道消化率有一定影响，其中蛋白、ＡＤＦ和ＮＤＦ消化率有一定的下降。各种过瘤胃脂肪之间存在着一定的差异，尤其是对蛋白消化率来说影响程度不同，这方面的工作还需更深入的研究。参考文献［１］韩正康，陈杰．反刍动物瘤胃的消化和代谢［Ｍ］．北京：科学出版社，１９８８：１９．［２］卢德勋，谢崇文．现代反刍动物营养研究方法和技术［Ｍ］．北京：农业出版社，１９９３．［３］史清河，韩友文．全混合日粮对羔羊瘤胃代谢产物浓度变化的影响［Ｊ］．动物营养学报，１９９９，１１（３）：５１－５７．［４］谭支良，卢德勋，胡明，等．绵羊日粮中不同碳水化合物比例对瘤胃内环境参数的影响［Ｊ］．动物营养学报，２０００，１２（１）：４２－４７．［５］杨胜．饲料分析及饲料质量检测技术［Ｍ］．北京：北京农业大学出版社，１９９３．［６］赵广永．瘤胃发酵调控研究进展［Ｊ］．动物营养学报，１９９９（１１）：２１－２８．［７］菜青和，贾志海．绵羊日粮中添加不同水平脂肪酸钙对养分消化的影响［Ｊ］中国农业大学学报，２００１，６（３）：１１３－１１８．［８］ＨＯＯＶＥＲＷＨ，ＳＴＯＲＫＥＳＳＲ．Ｂａｌａｎｃｉｎｇｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｓｆｏｒｏｐｔｉｍｕｍｒｕｍｅｎｍｉｃｒｏｂｉａｌｙｉｅｌｄ［Ｊ］．ＤａｉｒｙＳｃｉ，１９９１，７４：３６３０．［９］ＪＥＮＫＩＮＳＴＣ，ＰＡＬＭＱＵＩＳＴＤＬ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｆａｔｔｙａｃｉｄｓｏｒｃａｌｃｉｕｍｓｏａｐｓｏｎｒｕｍｅｎａｎｄｔｏｔａｌｎｕｔｒｉｅｎｔｄｉｇｅｓｔｉｂｉｌｉｔｙｏｆｄａｉｒｙｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＤａｉｒｙＳｃｉ，１９８４，６７：９７８－９８６．［１０］ＲＯＢＩＮＳＯＮＰＨ．Ｄｙｎａｍｉｃａｓｐｅｃｔｓｆｅｅｄｉｎｇｍａｎａｇｅｍｅｎｔｆｏｒｄａｉｒｙｃｏｗ［Ｊ］．ＤａｉｒｙＳｃｉ，１９８９，７２：１１９７－１２０９．［１１］ＲＯＧＥＲＳＧ．Ｆａｔｔｙａｃｉｄｃａｌｃｉｕｍｓｏａｐｓａｓｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓｆｏｒｇｒａｚｉｎｇｄａｉｒｙｃｏｗｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＡｕｓｔｒａｌｉａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＡｎｉｍａｌＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．１９８８（１７）：４５９．［１２］ＤＥＶＡＮＴＭ，ＦＥＲＲＥＴＡ，ＧＡＳＡＪ，ｅｔａｌ．Ｅｆｆｅｅｃｔｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｄｅｇｒａｄａｂｉｌｉｔｙｏｎｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ｒｕｍｅｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｒａｐｉｄｌｙｇｒｏｗｉｎｇｈｅｉｆｅｒｓｆｅｄｈｉｇｈ!ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄｉｅｔｓｆｒｏｍ１００ｔｏ２３０ｋｇｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔ［Ｊ］．ＡｎｉｍＳｃｉ，２０００，７８（６）：１６６７－１６７６．［１３］ＪＥＮＫＩＮＳＴＣ，ＦＯＴＯＵＨＩＮ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｌｅｃｉｔｈｉｎａｎｄｃｏｒｎｏｉｌｏｎｓｉｔｅｏｆｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．Ｒｕｍｉｎａｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｓｈｅｅｐ［Ｊ］．ＡｎｉｍＳｃｉ，１９９０，６８：４６０－４６６．［１４］ＣＨＲＩＳＴＩＡＮＳＥＮＷＣ．Ｒａｔｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｒｕｍｅｎｐｒｏｔｏｚｏａｌｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＡｎｉｍＳｃｉ，１９９０，２３：９８４．［１５］ＤＥＶＥＮＤＲＡＣ，ＬＥＷＩＳＤ．Ｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｄｉｅｔａｒｙｌｉｐｉｄｓａｎｄｆｉｂｒｅｉｎｓｈｅｅｐ［Ｊ］．ＡｎｉｍａｌＰｒｏｄ，１９７４（１９）：７６－８４．［１６］ＢＯＯＤＩＯＬＵＰ．Ｆａｔｔｙａｃｉｄｃａｌｃｉｕｍｓｏａｐｓｉｓａｎｉｍａｌｆｅｅｄｉｎｇ［Ｊ］．ＲｉｖｉｓｔｓＩｔａｌｉａｎａ!ｄｅｌｌｅＳｏｓｔａｎｚｅＧｒａｓｓｅ，１９９３（７０）：６２７１－６２７４．［１７］ＹＯＵＮＧＢＫ．Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌｄｉｅｔａｒｙｆａｔｆｒｏｍｅｘｔｒｕｄｅｄｓｏｙｂｅａｎｓａｎｄｃａｌｃｉｕｍｓｏａｐｓｏｆｆａｔｔｙａｃｉｄｆｏｒ１ａｃｔａｌｉｎｇｄａｉｒｙｃｏｗｓ［Ｊ］．ＤａｉｒｙＳｃｉｅｎｃｅ，１９９３（７６）：１９７－２０４．［１８］ＭＯＵＬＤＦＬ，ＯＲＳＫＯＶＥＲ．ＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆｒｕｍｅｎｆｉｕｉｄｐＨａｎｄｉｔｓｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｎｃｅｌｌｕｌｏｌｙｓｉｓｉｎｓａｃｃｏ，ｄｒｙｍａｔｔｅｒｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｒｕｍｅｎｍｉｃｒｏｆｌｏｒａｉｎｓｈｅｅｐｏｆｆｅｒｅｄｅｉｔｈｅｒｈａｙｏｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ［Ｊ］．ＡｎｉｍＳｃｉ，１９８３（１０）：１．［１９］ＡＬＩＩＡＤＲＡＭＩＧＡ，ＮＩＧＭＡＡ，ＫＨＯＬＩＦＡＭ，ｅｔａｌ．ＥｆｆｅｃｔｏｆｒｏｕｇｈａｇｅｔｏｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｒａｔｉｏｓｏｎｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅａｎｄｃａｒｃａｓｓｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｌｏｃａｌｌａｍｂｓｉｎｔｈｅＵｎｉｔｅｄＡｒａｂＷｍｉｒａｔｅｓ［Ｊ］．ＡｒａｂＧｕｌｆＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，１５（１）：１３７－１４８．［２０］ＡＬＨＡＤＨＲＡＭＩＧ，ＨＵＢＥＲＪＴ．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＡｌｆａｌｆａｈａｙｖａｒｙｉｎｇｆｉｂｅｒｆｅｄａｔ３５％ｏｒ５９％ｏｆｄｉｅｔｏｎｌａｃｔａｔｉｏｎａｎｄｍｕｔｒｉｅｎｔｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｂｙｄａｉｒｙｃｏｗｓ［Ｊ］．ＤａｉｒｙＳｃｉ，１９９２，７５：３０９１－３０９９．［２１］ＣＨＡＮＤＲＡＭＯＮＩＸＸ，ＪＡＤＨＡＯＳＢ，ＴｉｗａｒｉＣＭ，ｅｔａｌ．ＣａｒｂｏｎａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎｂａｌａｎｃｅｓｔｕｄｉｅｓｉｎＭｕｚａｆｆａｒｎａｇａｒｉｓｈｅｅｐｆｅｄｄｉｅｔｓｖａｒｙｉｎｇｉｎｒｏｕｇｈａｇｅａｎｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｒａｔｉｏ［Ｊ］．ＳｍａｌｌＲｕｍｉｎａｎｔＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９９，３１（３）：２２１－２２７．［２２］ＳＴＯＲＲＹＪＥ．Ｐｒｏｔｅｃｔｅｄｌｉｐｉｄｓｉｎｒｕｍｉｎａｎｔｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｇｒｉｃｔ［Ｊ］．ＤｅｖＡｄｖＳｅｖ，１９７４（１５）：９６．!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!（上接第２１４７页）安徽农业科学２００６年２１５０