第21卷 第1期 天 津 农 学 院 学 报 Vol. 21，No. 1 2014年3月 Journal of Tianjin Agricultural University March，2014

收稿日期：2013-12-19 基金项目：国家自然科学基金项目“牛骨骼肌卫星细胞成肌分化相关miRNAs的鉴定和功能研究”（31201021）；天津市自然科学基金项目“microRNA-1对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控作用研究”（13JCQNJC14600） 作者简介：代阳（1988-），女，内蒙古通辽人，硕士在读，研究方向为动物胚胎与转基因工程。E-mail: aq19881209@163.com。 通信作者：丁向彬（1978-），男，河南南阳人，副教授，博士，研究方向为动物胚胎工程与繁殖生物技术。E-mail: xiangbinding@163.com。

文章编号：1008-5394（2014）01-0001-04 小鼠骨骼肌卫星细胞的分离培养和鉴定 代阳1，王轶敏1，2，刘新峰1，樊晗璐1，李吉霞1，郭宏1，丁向彬1，通信作者 （1. 天津农学院 动物科学与动物医学学院，天津 300384；2. 西北农林科技大学 生物工程研究所，陕西 杨凌 712100） 摘 要：采用胶原酶和胰酶联用的酶消化法分离小鼠骨骼肌卫星细胞，应用差速贴壁法进行纯化，并利用RT-PCR和免疫荧光染色方法对分化前后细胞的标志基因进行鉴定。结果显示：分离出的肌卫星细胞生长状态良好，RT-PCR和免疫荧光染色显示肌卫星细胞Pax7和MyoD呈阳性表达，诱导分化形成肌管后，分化标志基因MyoG和MHC呈阳性表达。本研究成功从小鼠肌肉组织中分离出了肌卫星细胞，并具有很好的体外分化能力，可以为肌肉的发育分化和损伤修复研究提供良好的细胞模型。 关键词：小鼠；骨骼肌卫星细胞；细胞培养；鉴定 中图分类号：Q813.1 文献标识码：A

Isolated Culture and Identification of Mouse Skeletal Muscle Satellite Cells DAI Yang1, WANG Yi-min1,2, LIU Xin-feng1, FAN Han-lu1, LI Ji-xia1,

GUO Hong1, DING Xiang-bin1,Corresponding Author

(1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Institute of Bioengineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi Province, China)

Abstract: In this study, mouse skeletal muscle satellite cells were isolated by collagenase and trypsinase digestion method. Then the satellite cells were purified and induced to differentiate into myotubes, and the marker genes of the cells before or after the differentiation were detected by RT-PCR and immunocytochemistry technology. The results show that the isolated muscle satellite cells were healthy, and expressed the marker genes of paired protein box (Pax7) and myogenic differentiation antigen (MyoD). After inducing to the myotubes, myogenin (MyoG) and myosin heavy chain (MHC)showed positive expression. The results indicate that mouse skeletal muscle satellite cells of high purity, which can provide cell sources for muscle development and damage repair study, are successfully isolated. Key words: mouse; skeletal muscle satellite cell; cell culture; identification

骨骼肌卫星细胞（skeletal muscle satellite cell）是骨骼肌中具有分化增殖潜能的肌源性干细胞，通常以静息状态存在于肌纤维肌膜与基底膜之间[1]，

在一定条件下可以被激活，发生增殖和分化，形成骨骼肌细胞。1961年，Mauro[2]首次在蛙的肌肉

中发现了肌卫星细胞，其后，有多种动物的肌卫星细胞被成功分离，并进行了体外培养。肌卫星细胞在肌肉的发育和再生中发挥了重要作用，而肌卫星细胞的增殖和分化受众多因素的影响[3]，目

前，其分离效率仍然很低，建立高效的体外培养、鉴定与诱导分化方法仍然是卫星细胞研究和利用的关键。本研究采用胶原酶和胰蛋白酶联用的酶消化法从小鼠肌肉组织中分离肌卫星细胞，并对其进行了诱导分化和鉴定，以期为肌肉的发育分化和损伤修复研究提供参考。

1 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验动物 10日龄昆明小鼠，体重约3.2 g。 1.1.2 主要试剂 胎牛血清（Gibco）；马血清（Gibco）；DMEM高糖培养基（Hyclone）；胶原酶Ⅱ（Sigma）；0.25%胰蛋白酶溶液（索来宝）；青链霉素混合液（10 000 mg /L青霉素、10 000 mg/L链霉素，索莱宝）；PBS（自配）；4%多聚甲醛、山羊封闭血清、羊抗兔Cy3标记二抗、羊抗兔FITC标记二抗、羊抗小鼠FITC标记二抗（武汉博士德）；DAPI、兔抗Pax7抗体、兔抗MyoD抗体、兔抗MyoG抗体（北京博奥森）；鼠抗Myosin抗体（中杉金桥）；TRIzol试剂（Invitrogen）；天 津 农 学 院 学 报 第21卷 ・2・ 反转录试剂（Takara）；PCR试剂（康为世纪）；细胞培养板、离心管、培养皿等（Corning）。 1.2 实验方法 1.2.1 小鼠肌卫星细胞分离培养 将小鼠颈椎脱臼处死后，浸泡于75%酒精中消毒5 min，然后在无菌条件下剥开后肢皮肤。将后肢切下后于平皿内小心去掉脂肪和骨骼，留肌肉组织。将肌肉组织用PBS冲洗后，于无菌平皿中用眼科剪反复剪碎至1 mm3大小。组织块置PBS中

静置，弃上清液。将PBS清洗后的组织块置于适量0.2%胶原酶Ⅱ中，于37 ℃消化1 h，每10 min振荡一次。1 000 r/min离心10 min后弃上清液，再加入0.25%胰酶，于37 ℃消化30 min，每10 min振荡一次。之后，加入含血清的生长培养基（含20%胎牛血清的DMEM培养基）终止消化，细胞悬液分别过100、200和400目细胞筛，过滤后的细胞悬液于1 000 r/min离心10 min，弃上清液，细胞沉淀用生长培养基重悬后接种于60 mm直径培养皿内，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2.2 肌卫星细胞纯化及传代培养 采用差速贴壁方法进行纯化，分离出的细胞在培养箱中培养2 h，此时贴壁细胞主要为成纤维细胞。然后，将未贴壁细胞转入新的培养皿中培养，第4天换液，去除血细胞及未贴壁的死细胞，并观察细胞生长情况。 细胞生长至70%汇合时传代，弃去培养皿中培养基，PBS洗涤1～2次后加入适量0.25%胰酶消化液，显微镜下观察，细胞胞质回缩、开始变圆时用手轻拍培养皿。当绝大部分细胞脱落后，立即加入含血清培养基终止消化，细胞悬液用枪头反复吹吸后，于1 000 r/min离心10 min，弃上清液，细胞沉淀重悬后按1∶2或1∶3接种于新培养皿内，3～5 d传代一次，每次传代均差速贴壁30 min，以去除成纤维细胞。 1.2.3 肌卫星细胞诱导分化 肌卫星细胞传代培养贴壁后，将培养基更换为分化培养基（含2%马血清的DMEM）进行成肌诱导分化培养，观察肌卫星细胞分化情况及肌管形成状态。 1.2.4 免疫染色鉴定 对纯化后的肌卫星细胞和诱导分化后的肌管进行免疫荧光染色鉴定。细胞经PBS清洗1～2次后，加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤3次，每次5 min；然后，用含0.1% Triton X−100的PBS透化处理20 min，PBS洗涤3次，每次5 min；之后，

正常山羊血清封闭30 min，弃去血清，不洗，分别加入Pax7、MyoD、MyoG和MHC一抗（1∶100）， 4 ℃过夜，PBS洗涤3次，每次5 min；再加入相应的FITC或Cy3标记二抗（1∶100），37 ℃孵育1 h，PBS洗涤3次，每次5 min；最后，加入DAPI染核，荧光显微镜观察。 1.2.5 RT-PCR鉴定 采用TRIzol法提取未分化肌卫星细胞和分化后肌管总RNA，按照RT-PCR试剂盒说明，以Oligo （dT）15和随机引物为引物，在20 μL体系中合成cDNA，以cDNA为模板，加入Pax7、MyoD、MyoG和MHC基因上、下游引物进行PCR，GAPDH作为内参照，引物序列见表1。25 μL体系反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循环35次；72 ℃延伸2 min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统采集图像。

表1 小鼠Pax7、MyoD、MyoG、MHC和GAPDH 基因引物序列表

名称 序列（5’−3’） 扩增产物/bp上游引物CCCTCTGGAGACGGAAAACCPax7下游引物GCTCTGTGACTGAGGACACC310

上游引物TTTCGACTCACCAGACCTGCMyoD下游引物GAGATGCGCTCCACTATGCT675

上游引物GAGGAAGTCTGTGTCGGTGGMyoG下游引物CCACGATGGACGTAAGGGAG395