微生物多酚
氧
化酶研究进展
赵淑娟王冲波傅冬和(湖南农业大学园艺园林学院多酚氧化酶(PolyphenolOxideasPO)是从真菌到植物乃至哺乳动物体内都广泛存在的一类铜蛋白它能有效催化多酚类化合物氧化形成相应的醒类物质在茶儿茶素氧化形成茶黄素的过程中多酚氧化酶与过氧化物酶(POD)起着非常重要的作用尤其是多酚氧化酶总活性是茶黄素形成的主要制约因子随着微生物研究领域的发展研究人员在许多微生物中发现含有多酚氧化酶并已利用其进行了含酚废水处理木质素降解以及染料脱色等领域的研究在合成茶黄素方面也进行了相关的尝试本文对微生物中多酚氧化酶的种类性质及微生物生产多酚氧化酶的条件等方面的研究进行综述旨在为筛选合成茶黄素的有效菌种提供理论依据一微生物多酚氧化酶的种类多酚氧化酶是自然界中分布极广的一种氧化还原酶普遍存在于植物真菌昆虫的质体中甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的酿在广义上多酚氧化酶可分为三大类:酪氨酸酶(Ec114181肠orsinase)儿茶酚酶(EC11031Cateeholoxidase)和漆酶(EC11032加case)在这三大类多酚氧化酶中儿茶酚酶主要分布在植物中微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶1微生物漆酶漆酶是三大类多酚氧化酶中作用底物最广的一类漆酶最早是在1883年由Yoshida首先从漆树液中发现的后来人们又从大量的真菌体中发现了漆酶漆酶来源很多结构各异不同来源的漆酶表现出来的催化特性相差较大即便是同一来源如同一白腐菌菌种也可分泌出不同性质的漆酶组分包括氧化能力最适pH底物专一性等因此催化氧化作用也各不相同漆酶是一种典型含铜糖蛋白具有特征性吸收光谱通常认为每个漆酶蛋白分子中含有4个铜离子分属于3类其中I型l个n型1个nI型2个漆酶分子中的铜离子是漆酶催化反应的活性中心在催化氧化过程中起决定作用漆酶的催化氧化反应需要氧气的参与其机理主要表现在底物自由基的生成和漆酶分子中4个铜离子的协同作用当漆酶催化酚类(如氢醒)氧化时首先是底物氢醒向漆酶转移1个电子生成半醒—氧自由基中间体用ESR可观察到明显的自由基信号其次是不均等非酶反应2分子半醒生成1分子对苯醒和1分子氢醒氧自由基中间体还能转变成碳自由基中间体它们可以自身结合或相互偶联产物李园莉雷玉国李勤教育部茶学重点实验室410128)中除醒外还有聚合物和C一OC一C偶联产物在氧气的存在
下还原态漆酶被氧化氧气被还原成水漆酶催化底物氧化和对氧气的还原是通过4个铜离子协同地传递电子和价态变化实现的在真菌中漆酶大多分布在担子菌(Basiidmcyetes)
多
孔菌(oP加。二)子囊菌(Aoom少亡etes)脉抱菌(Neuor印oar)柄抱壳菌(oP一dosPoar)和曲霉菌
(A、eP哪u。)等真菌中担子菌中的白腐菌是目前获得漆酶
的主要来源iGvaudan等还从稻根上的生脂固
氮螺菌
(注:05户iirzzumziPoferum)中分离出细菌漆酶
黄乾明等以粗毛栓菌门h切王。t。列iloa)为出发菌通
过紫外诱变处理其担抱子PDA一RBBR平板变色法初筛ABST〔2,2一边氮基一双(3一乙基苯并唾毗咯琳一6一磺
酸)
〕
法测定培养液漆酶酶活力复筛获得1株漆酶高产诱变菌株SAH一12
黄俊等(206)从森林树木根部土壤中分离得到1株具
有漆酶活性的细菌菌株并鉴定该细菌属于克雷伯氏菌(`le占siella)属命名其为Klo6、iellasp一601这是首例报道lK。阮iclla细菌具有漆酶活性
另外在国外还有很多菌种的漆酶基因得到了克隆并
且
进行了分析和鉴定包括粗毛云芝(Coirolushiout。)云
芝
(升丈训eet、:。。icolo:)射脉菌(hPleibandri以a)长绒毛栓
菌(Zh训巴ets:流此a)未红密孔菌(乃
二
noP
~
。inrzbz二nus)糙皮侧耳(瓜uortoosetratus)灰盖鬼
伞
(oCPirn。。i、er。)脉胞菌(Ne“or`poarc心sa)构巢
曲霉
(A切e哪10nidul*)和立枯丝核菌(尺h众oetoni
a、o
l
an
i
)
等2微生物酪氨酸酶
酪氨酸酶又叫单酚氧化酶它可以氧化L一酪氨酸合成L一多巴和黑色素在高等动物和人类中酪氨酸酶的活性高
低与黑色素的形成速率有关缺乏此酶活性将引起白化病对酪氨酸酶的光谱研究表明它的活性中心有2个Cu+2
能与周围的氮原子和氧原子形成3种不同的形态分
别为铜离子态(Emet)氧一铜离子态(Eoxy)和亚铜离子态
(Edeoxy)人们最早研究的酪氨酸酶基本功能有两个:一是
作为单酚酶使单酚及其衍生物邻位经基化生成邻二酚及其衍生物;二是作为双酚酶氧化邻二酚及其衍生物生成相应的
醒其催化机理如图1所
示
有报道说一种假单胞菌(乃。udomonosP)具有高产酪氨酸酶的能力另一种细菌即弗氏柠檬杆菌(
iC占orbac
t。;
介udni)在L一酪氨酸诱导下能高效表达酪氨酸酶的催化活
性经小试试验可获得L一多巴产量.9sg/L为其中试生产奠
定了基础图1酪氨酸酶催化酚类化合物氧化的机理蔡信之等分离并鉴定出嗜麦芽假单胞菌Pss以tP1能够稳定地产生酪氨酸酶并催化产生黑色素他们已将该菌的酪氨酸酶基因(mel)片断克隆到.Ecoil质粒载体pUC18上构建了产生黑色素的工程菌.Ecoli/pwSYUfangRuan(2以)4)首次发现苏云金芽抱杆菌高温诱导产黑色素的新现象并进一步发现该黑色素的产生也是经酪氨酸酶氧化酪氨酸途径产生的目前报道能产生黑色素的细菌有eA~A么超肋石`etrj巧℃砧二份~icM,,cus撇边出汤哪otmy(二e、V访而R入众。bilun和hse~阮酪氨酸酶催化合成黑色素是s加,otnlcye、属的典型特点此特点已被视为其分类的依据二微生物生产多酚氧化酶的条件杨建明等对木耳属中3个种27个菌株产生过氧化物酶和漆酶的能力进行筛选后得到一漆酶高产菌株毛木耳(Auicrulariapo尔成ha)A4P并对A4P产生漆酶的发酵条件进行了初步研究最佳培养基为:碳源梭甲基纤维素(CMC)59/L氮源NH洲03+L一天冬酞胺(L一sp毋久多ne)24mmol/L培养基的初始pH值为.40培养温度25℃邵强等对筛选到的一株高漆酶合成的白腐真菌进行了碳源和氮源的利用研究结果表明其漆酶合成的最适碳源为葡萄糖最适氮源为酵母浸出汁碳氮源的最佳组成为:葡萄糖109L/酵母浸出汁79/oL王戈林等研究了表达酪氨酸酶的基因工程菌(云C成WYS)产黑色素的条件WYB能在酪素平板上产生可溶性黑色素在添加酪氨酸的液体比培养基中的黑色素产率是基因来源菌—尸sel以omDnasmalt叩hil她的5倍并对摇瓶装量菌龄底物浓度发酵温度和pH等因素的影响作了进一步探讨发现培养基中高浓度的优良氮源—蛋白陈对发酵产黑色素非常有利这一方面是因为工程菌不仅要合成自身的各种蛋白质与酶还要大量合成酪氨酸酶对氮源的需求大为增加;另一方面葡萄糖作为碳源浓度高于.05%时工程
菌就不能产生黑色素可能是葡萄糖对合成酪氨酸酶有很
强的阻遏作用或是高浓度的葡萄糖存在时细菌生长速率过高导致携有酪氨酸酶基因的重组质粒分离不稳定而丢失尸爪日翻,ihl记对碳氮源的要求恰恰相反说明酪氨酸酶
基
因转人大肠杆菌后由于所处遗传环境的变化产酶的营养要求有了很大改变在wF发酵培养基中在适宜的发酵条件下工程菌有l6mg/mL的黑色素产率酪氨酸酶是黑色素产生的关键酶黑色素的产率直接显示了酪氨酸酶的合成情况
宁华用正交试验优化了基因工程菌(EcoilP/wsy
)
产黑色素培养基的组成配方为:蛋白陈1%葡萄糖.02%硫酸钱.05%磷酸氢二钾.07%磷酸二氢钾.03%氯化钠.05%硫酸镁.001%
上述研究为实现微生物发酵法大规模
生产黑色素提供了重要数据
利用微生物生产多酚氧化酶一般都是通过微生物发酵让菌株在利于其产酶的碳源氮源pH值温度等环境条件下予以适当诱导使其分泌多酚氧化酶微生物发酵法有易培养繁殖快易诱导在短时间内能廉价地生产多酚氧化酶的特点这使有效利用多酚氧化酶成为可能刘尚旭等对糙皮侧耳(凡“orooser二)xA3菌的漆酶产生条件进行了研究结果发现该菌漆酶产量较高的条件是:培养温度25℃培养基pH二.55每升含C.02529N.00219;加人.005%一0or%的吐温可提高漆酶酶活12倍王宜磊研究了碳源氮源愈创木酚香兰素及培养条件对漆酶分泌的影响结果表明麦草粉作碳源(NH;)多04作氮源有利于漆酶的分泌;适宜浓度的愈创木酚和香兰素等对漆酶的产生有一定的作用;pH在.30一8.0的范围内变动时对漆酶的分泌影响不大;培养温度接种量通气量对漆酶的分泌有较大影响分泌漆酶的最适pH值为.40最适反应温度为30℃Kzn,Cu,可激活漆酶而AgFe,CI则抑制漆酶活性三、微生物多酚氧化酶的性质1微生物漆酶的性质
漆酶在微生物中分布非常广泛因此研究者们对多种
不
同菌种合成的漆酶的性质做了比较全面的研究杨建明对毛木耳AuicruliarapolrticrhaA4P的粗酶液
进行PAGE电泳后发现含有3种漆酶同工酶并且通过运
用NativeSDS一以GE获得3种漆酶的分子量大小分别约为:LaeA(110kD)aLeB(84kD)LaeC(65kD)重点研究了LacB漆酶得到其反应的最适温度为30℃最适pH为
30此酶氧化ABST的Km值为664xl0巧mmol/L金属离子
对酶活的影响很大其中Ca,Mg,ZnZNaAg对漆酶LaeB有明显的激活作用;Co,Hg,Fe,Fe,BaZ
等对酶活
有明显的抑制作用LacB和其他真菌漆酶一样具有底
物专
一性不强的特点并且LacB对RB亮兰染料有很好的脱色作用