抗原刺激B细胞活化分泌特异性抗体 抗原抗体复合物经典途径激活补体系统
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识别阶段
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活化阶段
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膜攻击阶段
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实验二 抗体生成细胞检测
免疫学教研室 李宗喜 5346
脾脏
第二大免疫器官 捕获血源性抗原 储存血液
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小鼠B细胞溶血空斑形成试验
溶血空斑形成试验是基于抗原抗体反应可 活化补体，溶解细胞的原理来检测抗体形 成细胞的一种体外试验方法，是用于检查 动物的抗体产生功能的经典的试验。
7. 微量进样器和离心机等。
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操作步骤
免疫小鼠 血清分离 脾细胞分离、计数 溶血空斑试验
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血清分离
眼球取血：左手抓住小鼠颈部皮肤，轻 压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽 量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突 出。用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒 立，用1.5mlEp管接住流出的血液。每 次采血量1－2ml。
ELISPOT不仅可应用于B细胞分泌抗体功 能的测定，也能检测分泌细胞因子的T细 胞和巨噬细胞。
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结束
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将SRBC免疫过的小鼠脾细胞制成细胞悬液， 与一定量的SRBC在琼脂凝胶内混合，在补 体参与下，使抗体产生细胞周围的SRBC溶 解，形成一个肉眼可见的溶血空斑。主要 用于测定B细胞抗体产生能力。
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实验原理
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使用显微镜
安放好载玻片 打开电源 调整瞳孔间距 调整光源 先粗调，再微调 10×物镜找到细胞层和计数室 40×物镜找到白细胞计数区域
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细胞计数板（Hemacytometer）
表面雕刻有带刻度的计数室用来计数细 胞和微粒的特制玻璃板。
2ml冷NH4Cl裂解RBC约5min 1500r/min再离心5min去上清
Hank’s液5ml洗涤细胞，2000r/min离心10min去上清
悬浮细胞于1ml的Hank’s液中
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脾细胞计数
10倍稀释脾细胞悬液 计数脾细胞 调整细胞浓度至2×l06/ml
4℃静置24h，离心10000rpm，5min，收 集血清，-80℃保存待抗体水平检测。
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脾细胞分离计数
处死小鼠 取脾 制备脾细胞悬液 脾细胞计数
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取脾
70%酒精浸湿皮毛，右侧卧位 左侧肋骨最低点与髋关节间做
2.5cm切口 镊子钝性分离结缔组织，暴露
腹膜 腹膜做2cm切口，暴露脾脏 分离结缔组织和系膜 脾脏放入5mlHank’s液的平皿中
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制备脾细胞悬液
镊子夹住脾
注射器吸取2mlHank’s液
刺入脾脏冲洗脾细胞
收集8ml细胞悬液于离心管
1500rpm离心10min去上清
溶血空斑试验
制作反应板 加样：30ul 温箱10分钟
双面胶 盖玻片
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定量溶血分光光度法（quantitative hemolysis spectrophotometry，QHS）
该法又称B细胞介导的红细胞定量溶血分光光 度法，是根据溶血空斑试验的原理衍化而来， 可用以测定由B细胞产生和分泌的抗体裂解红 细胞所释放的血红蛋白(以吸光值表示)，从而 反映机体的体液免疫功能。试验时，将免疫的 脾细胞与SRBC及新鲜豚鼠血清等体积混合，于 37℃水浴1小时，离心后测上清吸光值，其与 产生抗体的量成正比。
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细胞计数板
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计数方法
细胞浓度/ml=稀释倍数×4个方格的平均数×104 Department of Immunology
计数红细胞
细胞浓度/ml=稀释倍数×5个小方格总数×5×104
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溶血反应试验
溶血素 sRBC
C N.S.
பைடு நூலகம்
1 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.4ml
2 0.2ml 0.2ml
0.6ml
3 0.2ml 0.2ml 0.6ml
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ELISA-空斑试验
又称酶联免疫斑点试验ELISPOT。该法与 ELISA不同之处是，加入的待检标本是细 胞，而非可溶性物质；所使用的底物可 形成不溶性终产物。
试剂与器材
1. 小鼠；
2. 绵羊红细胞悬液（2.5%）；
3. 指示细胞悬液： 含10% 绵羊红细胞悬液
0.5ml，补体0.3ml，Hank’s液2.0ml；
4. 细胞裂解液0.17mol的NH4Cl； 5. Hank’s 液（pH7.2）、凡士林油；
6. 动物解剖器械、注射器（5ml）、平皿、试管、 吸管、载玻片、盖玻片、双面胶；