江苏农业科学２０１２年第４ｏ卷第４期
钟万芳，丁少军．细菌几丁质酶的结构与功能研究进展［Ｊ］．江苏农业科学，２０１２，４０（４）：１—３
细菌几丁质酶的结构与功能研究进展
钟万芳 ，丁少军
（１．南京林业大学，江苏南京２１００３７；２．江苏省农业科学院植物保护研究所，江苏南京２１００１４）
摘要：细菌几丁质酶因其潜在的应用价值而越来越受关注。细菌几丁质酶属于糖苷水解酶家族的１８、１９家族。
典型的细菌几丁质酶包括将成熟几丁质酶分泌到胞外的信号肽、起催化作用的催化区、特异性结合氨基葡萄糖及几丁
质的几丁质结合区以及一个功能尚不清楚的短的ｃ端区域。本文重点介绍了细菌几丁质酶的结构域及其功能。
关键词：细菌；几丁质酶；结构域
中图分类号：Ｑ９３９．１０５ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２—１３０２（２０１２）０４—０００１—０２
几丁质（ｃ￣ｔｉｎ）是真菌细胞壁的重要成分，与真菌细胞的
发生和维持以及分隔的形成有关，几丁质对真菌生长及其功
能具有重要意义。因此可以利用几丁质酶降解真菌细胞壁中
的几丁质，从而抑制甚至杀死病原真菌…。几丁质也是昆虫
体壁、内外表皮、呼吸道、肠腔等组织的主要成分，昆虫生长发
育的各个时期都需要一定量几丁质。几丁质代谢随昆虫的不
同生长发育阶段而变化，并保持相对稳定，这对昆虫正常生长
发育至关重要。高等植物和高等动物体内则不含几丁质，几
丁质酶对高等动物、植物没有直接毒性，因此选择几丁质酶来 破坏昆虫几丁质结构或几丁质代谢平衡，对于协同防治虫害
具有极大的发展潜力 。 。自２０世纪８０年代以来，已经从
动物、植物、微生物中克隆获得了几丁质酶基因。根据氨基酸
序列的同源性，糖苷水解酶可分为５８个家族 ，根据该分类
方法几丁质酶属于１８和１９家族。１８家族存在于大多数细
菌、真菌、病毒、线虫、昆虫、节肢动物、哺乳动物和一些植物 中 Ｊ，１９家族主要存在于植物和少数革兰氏阳性细菌中。细
菌几丁质酶由于潜在的商业用途颇受关注。目前，借助ｘ射
线晶体衍射技术和ＮＭＲ技术，黏质沙雷氏菌（Ｓｅｒｒａｔ／ａ ｉＴ￣ｒｃｅ８一
ｃｅｒｌ￣）６０ ｋｕ的几丁质酶Ａ 和环状芽孢杆菌（Ｂａｃ／／／ ｃｉｒｃｕ—
ｌａｎｓ）ＷＬ一１２株６ｏ ｋｕ的几丁质酶Ａ 的三维结构都已被解
析。本文重点介绍了细菌几丁质酶的结构域及其功能，旨在
为阐明其作用机理提供参考。
１细菌几丁质酶的结构域与功能
大多数细菌几丁质酶前体都具有相似的结构域，从Ｎ端
到Ｃ端依次为信号肽（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）、催化域（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｄｏ—
ｍａｉｎ）、几丁质结合域（ｃｈｉｔｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）及一个短的Ｃ端
区域。
收稿日期：２０１１—１０—０８
基金项目：国家自然科学基金（编号：３０５００３４１）；江苏省自然科学基 金（编号：ＢＫ２０１１６７８）；江苏省农业科技自主创新资金［编号：ＣＸ （０９）６１５］。 作者简介：钟万芳（１９７８一），男，福建上杭人，博士研究生，助理研究
员，主要从事微生物农药研究。Ｔｅｌ：（０２５）８４３９０８９１；Ｅ—ｍａｉｌ：
ｗｆｚｈｏｎｇ８８＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．ｃｒｌ。 通信作者：丁少军，男，博士，教授，博士生导师，主要从事生物技术研
究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｄｓｈａｏｊｕｎ＠ｎｊｆｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。 １．１信号肽
由于大多数细菌几丁质酶为胞外酶，因此都具有信号肽
序列，信号肽的剪切位点常位于２个Ａｌａ残基之间。几丁质
酶不同，其信号肽的长度及剪切位点也各不相同，但同源性较
高的几丁质酶信号肽的相似性也较高，如黏质沙雷氏菌、豚鼠
气单胞菌Ａｅｒｏｍｏｎａｚ ｃａｖｉａｅ）、肠杆菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）Ｇ一１
株的几丁质酶信号肽序列完全相同。有些细菌几丁质酶基因
在另一种细菌中表达时，信号肽剪切位点会发生改变，如环状
芽孢杆菌ＷＬ一１２几丁质酶Ａ的信号肽剪切位点在Ａｌａ４。一
Ａｌａ４ 之间，而在大肠杆菌中表达时却在Ａ ：一Ｌｅｕ，，之间 。
信号肽剪切位点发生改变可能是因为不同细菌在翻译后加
工、修饰及蛋白的输出机制不同所引起的。值得关注的是，
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｌｉｃａｔｕｓ的几丁质酶基因在自身宿主中表达时可分
泌到胞外，但在大肠杆菌中表达时却留在大肠杆菌细胞内 。
１．２催化域
催化域是几丁质酶催化几丁质水解的关键区域，同源性
较高，都含有２个高度保守的区段。其中Ｇｌｕ和Ａｓｐ残基高
度保守，可能是在降解几丁质时直接与几丁质糖苷键作用的
残基。须要指出的是，催化域的同源性与菌株的亲缘远近没
有关联，如气单胞菌Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｎｏ．１０Ｓ一２４菌株的几丁质 酶Ｃｈｉｌ、Ｃｈｉ２、Ｃｈｉ３催化域的相似性并不高 】。催化域的
保守氨基酸残基差异决定了该酶属于糖苷水解酶１８或ｌ９家
族，目前除链霉菌属、气单胞菌Ｎｏ．１０Ｓ一２４菌株、伯克霍尔
德氏菌等少数细菌的几丁质酶属于１９家族外，其他都属于
１８家族。
有些细菌几丁质酶含有多个催化域，如Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ
ｄｅｇｒａｄａｎｓ ２—４０几丁质酶Ｂ含有２个催化域，其中Ｎ端催化
域降解几丁二糖衍生物４ 一ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ—Ｎ，Ｎ 一ｄｉａｃｅ．
ｔｙｌｃｈｉｔｏｂｉｏｓｅ的速率是Ｃ端催化域的１３．６倍，而Ｃ端催化域
降解几丁三糖衍生物４ 一ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ—Ｎ，Ｎ ，Ｎ 一ｔｒｉ．
ａｃｅｔｙｌｃｈｉｔｏｔｒｉｏｓｅ的速率是Ｎ端催化域的２．７倍。进一步研究
发现，Ｎ端催化域和ｃ端催化域分别表现外切几丁质酶、内切
几丁质酶活性 。
１．３几丁质结合域
根据几丁质结合域三维结构的不同，可以分成Ｉ、Ⅱ和Ⅲ
型。真菌和植物的几丁质结合域属于Ｉ型；病毒和昆虫的几
丁质结合域属于Ⅱ型；细菌的几丁质结合域属于Ⅲ型。目前 一２一 江苏农业科学２０１２年第４０卷第４期
还不清楚这３种类型的结合域在功能上是否存在差异。
在许多细菌几丁质酶的几丁质结合域中，芳香族氨基酸
Ｔｙｒ和Ｔｒｐ高度保守，该结构域与纤维素酶、蛋白酶的序列也
存在相似性。几丁质酶通过不同折叠，将结合域中的芳香族
氨基酸暴露在分子表面，通过其实现与几丁质的结合。突变
试验证明了这一点，如Ｈａｒｄｔ等突变Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ ＣｈｉＡ１
几丁质结合域中的芳香族氨基酸Ｔｒｐ６８７后，基本消除了其与
几丁质的结合能力 。
与纤维素酶的纤维素结合域相似，几丁质酶的几丁质结
合域主要负责与几丁质结合，使催化域更好地发挥水解作用。
如Ｓｖｉｔｉｌ等发现，Ｖ／ｂｒ／ｏ ｈｏｒｖ￣几丁质酶ＣｈｉＡ的几丁质结合域
缺失后，丧失了结合到晶体几丁质的能力，虽然该几丁质酶仍
然能降解晶体几丁质，但是降解能力较野生型几丁质酶有所
下降” 。Ｋ＠ｍａ等发现缺失了几丁质结合域的Ａｅｒｏｍｏｎａｓ
ｓｐ．Ｎｏ．１０Ｓ一２４几丁质酶对胶体几丁质和晶体几丁质的水解
活性分别下降了３０％和６５％＿Ｉ 。在含有多个结构域的细菌
菌株中也发现类似结果，如嗜水气单孢菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ －
ｄｒｏｐｈｉｌａ）ＪＰ１０１几丁质酶９２有２个重复的几丁质结合域，在
其都存在的情况下，几丁质酶对粉末几丁质和胶体几丁质的
结合能力分别是单个几丁质结合域的ｌ２倍和１Ｏ倍 。几
丁质结合域可能还有其他作用，如Ｓｖｉｔｉｌ等发现，缺失了几丁
质结合域的 ｎ叫几丁质酶ＣｈｉＡ水解胶体几丁质的能力
下降了５倍，而且降解产物也由Ｎ一乙酰氨基葡萄糖单体变
为多聚体，增加了几丁质酶的内切活性 。
一些纤维索结合域除能结合纤维索分子外，还能结合几
丁质分子，一些几丁质结合域也能结合纤维素分子 。但是
许多几丁质结合域仍保留了结合特异性，如Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ的几 丁质酶ＣｈｉＡ１只能结合几丁质，不能结合纤维素 。Ｓｈｅｎ等
推测芳香族氨基酸或其他氨基酸的空间位置决定了这种特异
性 ，但是该推测还有待进一步证明。
１．４ Ｃ端区域
目前几丁质酶Ｃ端序列的作用尚不清楚，Ｔｓｕｊｉｂｏ等认为
假单胞菌属（Ａｈｅｒｏｎｏｍａｓ ｓｐ．）０—７菌株几丁质酶的ｃ端序列
由２０个氨基酸形成一个疏水核，在酶蛋白通过细胞膜时，此 疏水核起重要作用 Ｊ。
并非所有细菌几丁质酶都含有上述结构域，如多数肠杆
菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）不含几丁质结合域，而Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ
ＮＣＴＵ２几丁质酶ＣｈｉＮＣＴＵ２则只有催化域 。除上述结构
外，一些细菌几丁质酶还含有其他功能区域，如环状芽孢杆菌
ＷＬ一１２几丁质酶ＣｈｉＡ１、ＣｈｉＤ，苏云金芽胞杆菌几丁质酶
ＣｈｉＡ７１、ＣｈｉＡ７４、Ｉｃｈｉ、Ｋｃｈｉ、Ｓｃｈｉ等都含有黏蛋白Ⅲ型同源区
（ｆｉｂｍｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅⅢｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎ） Ｊ。
２细菌几丁质酶的三维结构
利用ｘ射线晶体衍射技术和ＮＭＲ技术，黏质沙雷氏菌
６Ｏ ｋｕ几丁质酶Ａ 和环状芽孢杆菌６０ ｋｕ几丁质酶Ａ 的
三维结构已被解析。其三维结构相似，都是由８条 螺旋和
８条卢折叠形成的（ ＋卢）８圆桶形结构，中心是由平行的卢
折叠结构组成的内桶，依次为卢１～卢８，并由 螺旋结构将其
逐个连接起来，在ａ螺旋和 折叠之间有一段无规则卷曲连
接，从而在桶状结构表面形成了一个底物结合部位。除了形 成桶状结构外，还有一个Ⅳ端口折叠丰富的结构域（几丁质
结合域）和一个小的ｏｔ＋ 结构域，其功能尚不清楚。其他１８
家族几丁质酶也具有相同的桶状结构，因此具有相同功能。
参考文献：
［１］Ｇｈａｓｅｍｉ Ｓ，Ａｈｍａｄｉａｎ Ｇ，Ｓａｄｅｇｈｉ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｆｉｒｓｔ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ａ ｂｉｆｕｎｃ—
ｔｉｏｎａｌ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ／ｌｙｓｏｅｙｍｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ ＳＧ２［Ｊ］．Ｅｎ－ ｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，４８（３）：２２５—２３１． ［２］刘东，陈月华，蔡峻，等．苏云金芽孢杆菌几丁质酶Ｂ特性及 其杀虫抑真菌的作用［Ｊ］．微生物学报，２００９，４９（２）：１８０—１８５．
［３］ＣａｉＹ Ｊ，Ｙａｎ ＪＰ，ＨｕｘＭ，ｅｔａ１．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａ—
ｇａｉｎｓｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｃｕｌｅｘ ｑｕｉｎｑｕ￣ｆａｓｃｉａｔｕｓ ｍｏｓｑｕｉｔｏｅｓ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｆｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｃｈｉＡＣ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏ・
ｂｉｏｌ，２００７，７３（２３）：７７４４—７７４６．
［４］Ｚｈｕ Ｙ Ｐ，Ｐａｎ Ｊ Ｒ，Ｑｉｕ Ｊ ｚ，ｅｔ ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｅｎｔｏｍｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｕｓ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｅｃａｎｉｉ［Ｊ］． Ｂｒａｓ Ｊ Ｍｉｃｍｂｉｏｌ，２００８，３９（２）：３１４—３２０． ［５］Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ Ｂ，Ｂａｉｒｏｃｈ Ａ．Ｕｐｄａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ—ｂａｓｅｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，１９９６，３１６（２）：６９５—６９６． ［６］钟万芳，姜丽华，阎文昭，等．苏云金杆菌以色列亚种几丁质酶基
因的克隆及序列分析［Ｊ］．遗传学报，２００３，３０（４）：３６４—３６９． ［７］Ｐｅｒｒａｋｉｓ Ａ，Ｔｅｗｓ Ｉ，Ｄａｕｔｅｒ Ｚ，ｅｔ ａ１．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ０ｆ ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ａｔ２．３Ａ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１９９４，２（１２）：１１６９一ｌ１８０．
［８］Ｊｅｅ Ｊ Ｇ，Ｉｋｅｇａｍｉ Ｔ，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉ－ ｂｍｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ １１Ｉ ｄｏｍａｉｎ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ ＷＬ一１２ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ
Ａ１［Ｊ］．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００２，２７７（２）：１３８８—１３９７． ［９］Ｗａｔａｎａｂｅ Ｔ，Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ，Ｏｙａｎ￣Ｗ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ
Ａ１ ｆｒｏｍＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓＷＬ—－１２ ｒｅｖｅａｌｅｄｉｔｓ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｒｅｌａｔｉｏｎ－－
ｓｈｉｐ ｔｏ ５ｅｒｒａｔ／ａ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ａｎｄｔｏｔｈｅｔｙｐｅⅢｈｏｍｏｌｏｇｙ ｕｎｉｔｓ ｏｆｆｉｂｒｏｎｅ— ｃｔｉｎ［Ｊ］．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９０，２６５（２６）：１５６５９—１５６６５． ［１０］Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｐ Ｗ，Ａｌｂｒｉｇｈｔ Ｃ，Ｂｅｎｔｌｅｌｄ Ｂ．Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｅｅｓ ｐｌｉｃａｔｕｓ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ一６３）ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ［Ｊ］．Ｊ Ｂｉｄ Ｃｈｅｍ，１９８８，２６３（１）：４４３—４４７．
［１１］ｓｈｉｍＭ，ＵｅｄａＭ，Ｋａｗａｇｕｃｈｉ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｃｈｉｆｉ— ｎａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍＡｅｒｏｍｏｎａｓ叩．Ｎｏ．１０Ｓ一２４［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙ Ａｃｔａ，１９９６，１３０５（１—２）：４４－４８． ［１２］冯俊丽，朱旭芬．微生物几丁质酶的分子生物学研究［Ｊ］．浙江
大学学报：农学与生命科学版，２００４，３０（１）：１０２—１０８． ［１３］ＨｏｗａｒｄＭ Ｂ，ＥｋｂｏｒｇＮＡ，ＴａｙｌｏｒＬＥ，ｅｔａ１．ＣｈｉｔｉｎａｓｅＢ ｏｆ“Ｍｉｃｒｏｂ— ｕｌｂｉｆｅｒｄｅｇｒａｄａｕｓ”２－４０ ｃｏｎｔａｉｎｓｔｗｏ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｄｏｍａｉｎｓ ｗｉｔｌｌ ｄｉｆｅｒ－
ｅｎｔ ｅｈｉｔｉｎｏｌｙｔｉｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，２００４，１８６ （５）：１２９７—１３０３．
［１４］ＨａｒｄｔＭ，Ｌａｉｎｅ ＲＡ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅｒｅｓｉｄｕｅｓｉｎｔｈｅ ｃｈｉｔｉｎ— ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ＣｈＢＤＣｈｉＡ１ ｆｒｏｍ ｅｈｉｔｉｎａｓｅ Ａ１ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ
ａｌｔｅｒｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ：ｕｓｅ ｏｆ ａ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ［Ｊ］．Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ，２００４，４２６（２）：２８６－２９７． ［１５］Ｓｖｉｔｉｌ Ａ Ｌ，Ｋｉｒｃｈｍａｎ Ｄ Ｌ．Ａ ｃｈｉｔｉｎ—ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｉｎ ａ ｍａｒｉｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｈｉｔｉｎａｓｅ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｈｉｔｉｎａｓｅｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ １，４一ｂｅｔａ—ｇｌｙｃａｎａｓｅｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，
１９９８，１４４：１２９９—１３０８．
［１６］Ｋ＠ｍａ Ｍ，Ｙｏｓｈｉｋａｗａｌ Ｔ，Ｕｅｄａ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｆａｍｉｌｙ １９ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓＤ．Ｎｏ．１０Ｓ一２４：ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｈｉｔｉｎ—ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｉｎ ｔｈｅ
ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００５，１３７（２）：２３５—２４２．
（下转第３页）