西北农业学报󰀁2007,16(3):33~36ActaAgriculturaeBoreali󰀁occidentalisSinica

纳米银的制备及其药效学研究*

邱󰀁刚1,李引乾1*,芮亚培1,曹光荣1,荆娜娜1,许登攀1,王󰀁亮2(1.西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌󰀁712100;2.林州市畜牧局,河南林州市󰀁456550)摘󰀁要:利用液相化学还原法制备出粒径范围在1~100nm的纳米银颗粒,以电镜进行表征,进行纳米银的安全性、稳定性和药效学试验。试验证明纳米银颗粒具有良好的稳定性和分散性,安全无毒,对奶牛子宫内膜炎的3种病原菌大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、链球菌均有良好的杀菌作用。关键词:纳米银;安全性试验;稳定性试验;MIC;MBC中图分类号:S859󰀁󰀁󰀁󰀁文献标识码:A󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁文章编号:1004󰀁1389(2007)03󰀁0033󰀁04StudyonPreparationofNanometerSilverandItsPharmacyQIUGang1,LIYin󰀁qian1*,REIYa󰀁pei1,CAOGuang󰀁rong1,JINGNa󰀁na1,XUDeng󰀁pan1andWANGLiang2(1.CollegeofAnimalSci󰀁Tech,NorthwestA&FUniversity,YanglingShaanxi󰀁712100,China;2.LinzhouLivestockBureau,LinzhouHe󰀂nan󰀁456550,China)Abstract:Toproducenanometersilverwithhighantibacterialactivity,securityandstablility.Chemi󰀁calreductionmethodwasapplied.Prepareprocess: ThesphericalnanometersilverwaspreparedwithAgNO3,NH3!H2OandH2O2undertheexistenceofsurfactantPolyvinylpyrrolidone(PVP).∀TheproductwasobservedbyTransmissionElectronMicroscope(TEM).Todeterminetheantibac󰀁terialeffectofnanometersilvertoE.coli,Staphylococcus,Streptococcus,antibacterialactivityinvitrowascarriedout.Thetestofstabilitywasdoneinroomandnormalatmosphere.Thetestofacutetoxicityonchickenisconductedtoevaluatethesecurityofnanometersilver.Thewell󰀁crystallizednanometersilverwithevensizecouldbeproducedbycontrollingthereactionconditions.Further󰀁more,thenanometersilverhashighantibacterialpropertyandbiologicalsecurity.Keywords:Nanometersilver;Preparation;Securitytest;Stabilitytest;Pharmacy󰀁󰀁纳米银(Nanometersilver)是指粒径位于1~100nm之间的银簇,也称为超微银粒子,由几个到几十个银原子团聚在一起所形成。纳米银具有很强的抗菌活性,以其独特的抗菌机理,完全没有耐药性及其它毒副作用的优势,有望成为很有发展前途的新一代奶牛子宫内膜炎治疗药物。1󰀁材料与方法1.1󰀁材料1.1.1󰀁仪器󰀁磁力加热搅拌器(国华79󰀁1型),烘箱,培养箱,SZ󰀁93自动双重纯水蒸馏器,JEM1230型透射电子显微镜,电子天平,超净工作台(AIRTECH),光学显微镜。1.1.2󰀁试剂硝酸银(天津市天感化工技术开发有限公司),30%过氧化氢(西安化学试剂厂),聚乙烯吡咯烷酮K30(西安富力化学厂),均为分析

*收稿日期:2006󰀁09󰀁01󰀁󰀁修回日期:2006󰀁12󰀁08基金项目:西北农林科技大学科技创新基金。作者简介:邱󰀁刚(1981-),男,汉族,硕士研究生,主要从事兽医药理学研究。*通讯作者:李引乾。纯;牛肉膏,蛋白胨,氯化钠,磷酸氢二钾,碳酸氢钠,琼脂,犊牛血清;环丙沙星,甲砜霉素,土霉素。1.1.3󰀁菌种和试验动物󰀁致病性大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、链球菌菌种均由西北农林科技大学兽医微生物实验室提供;3~10日龄健康雏鸡及健康成年大耳白兔均购于西北农林科技大学实验农场。1.2󰀁方法1.2.1󰀁纳米银的制备与表征󰀁配制0.1mol/L的硝酸银溶液20mL,滴入适量28%的浓氨水搅拌至澄明,不断搅拌并稍加热,向溶液中加入0.35g的PVP(Polyvinylpyrrolidone,聚乙烯吡咯烷酮K30)使其溶解,在冰浴状态下缓慢滴加20mL30%的H2O2于Ag(NH3)2+溶液中,剧烈搅拌至无气体放出,得含纳米银的悬浊液。离心或长时间沉淀并真空干燥可得纳米银粉[1~3]。用透射电镜可以观察纳米粒子的平均粒径。1.2.2󰀁安全性试验[4]󰀁LD50的测定:采用序贯法估算LD50及其可信限。分别进行2000mg/kg剂量水平的限度试验和5000mg/kg剂量水平的限度试验。2000mg/kg剂量水平的限度试验将纳米银混悬液通过灌胃给予1只雏鸡,未出现死亡,依次将纳米银混悬液给予另外4只雏鸡。5000mg/kg剂量水平的限度试验将纳米银混悬液给予1只雏鸡,该动物存活,将受试物给予另外2只雏鸡。这2只雏鸡都存活。如果5000mg/kg剂量水平的限度试验有3只或3只以上动物存活,则LD50大于5000mg/kg。最大耐受量试验(Maximaltolerancedose,MTD):即不引起受试动物死亡的最高剂量。 预试验:取10只雏鸡进行预试,禁食不禁水10h,灌胃给予纳米银混悬液10000mg/kg,观察雏鸡给药后反应及死亡情况。∀最大耐受量测定:20只雏鸡以纳米银混悬液灌胃3次,每次间隔4h。给药容量均为10000mg/kg体重,连续7d观察雏鸡的一般表现和死亡情况。#黏膜刺激性试验:采用家兔滴眼法,以10mg/mL、1mg/mL纳米银混悬液分别滴入4只健康成年家兔左眼睑内,右眼滴入生理盐水为对照,观察1、24、48、72h和第4天、第7天的反应,依此判定结果。1.2.3󰀁稳定性试验󰀁将制备好的纳米银在常温放置30d,60d,90d,观察其分散性是否发生变化,以纳米银粒子的平均粒径作为判断指标。1.2.4󰀁药效学试验󰀁最小杀菌浓度(MBC)和最低抑菌浓度(MIC)的测定[5]。 将纳米银配成1mg/mL浓度的混悬液。对照药物环丙沙星、土霉素以0.1mol/L盐酸溶解后配制成1mg/mL的浓度,甲砜霉素配制成1mg/mL浓度。∀每种药物各作一排试管,分别测定对3种细菌,即大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、链球菌的MIC。每排9支试管,每管加肉汤1mL,第1管加药液1mL,依次作倍比稀释至第7管,其浓度分别为0.50mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL、0.03125mg/mL、0.015625mg/mL、0.0078125mg/mL。第8管作为细菌对照,第9管作药液(1mg/mL)对照,第1~8管每管加菌液0.1mL(105~106CFU),37∃培养24h,每管再取0.1mL在琼脂平板培养基上接种,37∃再培养24h,计算菌落数。每次试验重复3次。#最小杀菌浓度(MBC)和最低抑菌浓度(MIC)的结果判定:最小杀菌浓度(MBC)的结果判定:判定方法用试验管药液与对照管和细菌对照管比较,观察液体清亮的培养管,并在平板培养基上的菌落平均数小于5个或无菌落生长的药液最小稀释倍数为最小杀菌浓度(MBC)。最低抑菌浓度(MIC)的结果判定:判定方法采用最小杀菌浓度管(MBC)的前一管,即1/2倍于MBC的浓度,抑制肉眼可见生长的试验管,并在琼脂平板培养基上只有少量细菌菌落生长的药液最大稀释倍数为最低抑菌浓度(MIC)。2󰀁结果与分析2.1󰀁纳米银的表征以下为纳米银成品的TEM,其粒径基本在20~30nm之间,分散良好。图1a和图1b为同一批次的不同样品,粒径均小于50nm,无可见聚集现象。2.2󰀁安全性试验2.2.1󰀁LD50的测定结果󰀁2000mg/kg剂量水平的限度试验:将受试物给予1只动物,未出现死亡。依次将受试物给予另外4只动物,也未出现死亡。5000mg/kg剂量水平的限度试验:将受试物给予1只动物,未出现死亡。依次将受试物给予另外2只动物,也未出现死亡。因为有3只或3只以上动物存活,则LD50大于5000mg/kg。!34!西󰀁北󰀁农󰀁业󰀁学󰀁报󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁16卷故该试验结果判定为LD50>5000mg/kg。2.2.2󰀁最大耐受量测定结果󰀁给予5日龄雏鸡灌胃纳米银混悬液,24h最大耐受量30g/kg,相当于临床剂量的3000倍。给药后7d内雏鸡情况良好,皮毛光泽,饮食正常,7d内给药组雏鸡无一例死亡。处死剖检观察给药组20只雏鸡的心、肝、脾、肺、肾等脏器,未观察到异常变化。2.2.3󰀁黏膜刺激性试验结果󰀁未出现眼结膜充血、水肿、畏光和流泪等反应。2.3󰀁稳定性试验图2a、2b、2c分别为30d,60d,90d的TEM,可以看出纳米银经30d,60d,90d的常温常压放置后分散性良好,无团聚现象,粒径仍然保持在20~30nm之间。2.4󰀁药效学试验体外抑菌试验可见纳米银对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的MIC、MBC与环丙沙星相当,对链球菌的MIC、MBC则分别为0.25和0.5mg/mL,高于环丙沙星和甲砜霉素,低于土霉素(表1)。

图1󰀁纳米银透射电镜图(%150000)Fig.1󰀁TheTEMofnanometersilver(%150000)

a.常温常压放置30d(%150000)preservationinroomandnormalatmosphere30daysb.常温常压放置60d(%120000)preservationinroomandnormalatmosphere60daysc.常温常压放置90d(%250000)preservationinroomandnormalatmosphere60days图2󰀁纳米银透射电镜图Fig.2󰀁TheTEMofnanometersilver表1󰀁最小杀菌浓度(MBC)和最低抑菌浓度(MIC)Table1󰀁DeterminationofMICandMBC/(mg!mL-1)供试菌种Pathogenicbacteria纳米银NanometersilverMBCMIC土霉素TerramycinMBCMIC环丙沙星CiprofloxacinMBCMIC甲砜霉素ThiamphenicolMBCMIC大肠杆菌E.coli0.1250.06250.500.250.1250.06250.250.125金黄色葡萄球菌Staphylococcus0.06250.0312510.500.06250.31250.500.25链球菌Streptococcus10.50210.1250.06250.250.125!35!3期󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁邱󰀁刚等:纳米银的制备及其药效学研究