大鼠脊髓来源神经干细胞分化的　

星形胶质细胞亚型观察　

王丰，屠冠军。朱悦　

（中国医科大学附属第一医院，沈阳１１０００１）　山东医药２０１２年第５２卷第２　

摘要：目的观察大鼠脊髓来源神经干细胞分化形成星形胶质细胞的亚型。方法用悬浮培养法培养大鼠脊　髓来源的神经干细胞，形成神经球后，以免疫荧光法鉴定神经干细胞；胶质纤维酸性蛋白（ＧＦＡＰ）抗体标记星形胶　质细胞，观察其星形胶质细胞的亚型。结果神经干细胞分化第７天，观察到星形胶质细胞共有４种亚型，其中胞　体延长型占２．３９％±０．１３％，扁平多角形占３２．３３％±２．０１％，星形占５９．８８％±３．１２％，双极型占５．３９％±　０．２７％。结论大鼠脊髓来源神经干细胞分化成的星形胶质细胞具有多样性，以星形、扁平多角形为主。　关键词：神经干细胞；星形胶质细胞；表皮生长因子；碱性成纤维细胞生长因子；神经元特异性烯醇化酶；胶质　纤维酸眭蛋白；髓鞘碱性蛋白　中图分类号：Ｒ７３９．４　文献标志码：Ａ　文章编号：１００２－２６６Ｘ（２０１２）０２－００１２－０３　

Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｕｂＷｐｅ　ｏｆ　ａｓｔｒｏｃｙｔｅ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　ｆｒ０ｍ　ｎｅｕｒａＩ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　

ＷＡＮＧ　Ｆｅｎｇ。ＴＵ　Ｇｕａｎ４ｕｎ　ＺＨＵ　ｒｕｅ　（Ｆｉｒｓｔ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｈｉｎａ　Ｍｅｄｗａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ　１１０００１，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ｓｕｂｔｙｐｅ　ｏｆ　ａｓｔｒｏｃｙｔｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｎｅｕｒａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ（ＮＳＣｓ）ｆｒｏｍ　ｓｐｉｎａｌ　ｃｏｒｄ　ｏｆ　ｒａｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｃｅｌｌｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｆｒｏｍ　ｒａｔ　ｓｐｉｎａｌ　ｃｏｒｄ．Ｉｍｍｕｎｏ—　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ＮＳＣｓ　ａｎｄ　ｄｅｔｅｃｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＧＦＡＰ　ａｆｔｅｒ　ＮＳＣｓ　ｄｉｆｉｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ．Ｔｈｅ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ　ａｎｄ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ｅａｃｈ　ｓｕｂｔｙｐｅ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｓｅｖｅｎ　ｄａｙｓ　ａｆｔｅｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ｆｏｕｒ　ｓｕｂｔｙｐｅ　ｏｆ　ａｓｔｒｏｅｙｔｅ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ：ｅｌｏｎｇａｔｅｄ，ｆｌａｔ　ａｎｄ　ｐｏｌｙｇｏｎａｌ，ｓｔａｒ　ｌｉｋｅ　ａｎｄ　ｂｉｐｏｌａｒ　ｔｙｐｅ．Ｔｈｅ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ｅａｃｈ　ｓｕｂｔｙｐｅ　ｗａｓ　２．３９％±０．１３％，　３２．３３％±２．０１％．５９．８８％±３．１２％ａｎｄ　５．３９％±０．２７％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｎｅｕｒａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　ｓｐｉｎａｌ　ｃｏｒｄ　ｏｆ　ｒａｔｓ　ＮｇＲ　ｈａｓ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｕｂｔｙｐｅｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｎｅｕｒａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ；ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ；ａｓｔｒｏｃｙｔｅ；ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；ｂａｓａｌ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；ｎｅｕｒｏｎ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｎｏｌａｓｅ；ｇｌｉａｌ　ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ　ａｃｉｄｉｃ　ｐｏｒｔｅｉｎ；ｍｙｅｌｉｎ　ｂａｓｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　

神经干细胞在脊髓损伤后神经再生的研究中备　

受关注。神经干细胞移植后在局部分化成神经元和　胶质细胞，有望促进脊髓损伤后的神经再生和功能　

恢复。星形胶质细胞在中枢神经系统疾病修复中扮　演重要角色，不同类型的星形胶质细胞具有不同的　

功能。神经干细胞分化形成的星形胶质细胞是否存　在不同类型，目前尚未见报道。２０１０年１０月～　

２０１１年６月，我们观察了大鼠脊髓来源神经干细胞　

分化形成星形胶质细胞的亚型，为神经干细胞定向　分化研究提供新思路。　

１材料与方法　

１．１　材料出生２４　ｈ内的Ｗｉｓｔａｒ大鼠；表皮生长　

因子（ＥＧＦ）和神经上皮干细胞蛋白（ｎｅｓｔｉｎ）兔抗　

基金项目：国家自然科学基金资助项目（８１０７０９７１／Ｈ０９１０）；辽宁省　教育厅科技研究资助项目（Ｌ２０１０６２１）。　

１２　鼠单克隆抗体，碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）、　

ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基、Ｂ２７、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ＠４８８羊抗兔　荧光二抗、ＰＩ和Ｚｅｎｏｎ　Ｔｆｉｃｄｏｒ荧光标记试剂盒；兔　

抗鼠神经元特异性烯醇化酶（ＮＳＥ）、胶质纤维酸性　

蛋白（ＧＦＡＰ）和髓鞘碱性蛋白（ＭＢＰ）抗体，分别是　神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的标志物。　

１．２方法　１．２．１神经干细胞的分离和培养取出生２４　ｈ内　

的Ｗｉｓｔａｒ大鼠４只，处死后在超净台内取出脊柱；以　

眼科剪刀剪开椎板，取出脊髓后置入装有４℃　

Ｄ—Ｈａｎｋｓ液平皿中。将脊髓剪碎，清洗后加入　

０．１２５％胰蛋白酶３７℃消化４０　ｍｉｎ；离心弃去胰酶，　加入添加有Ｂ２７、２０　ｎｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦ和２０　ｎｇ／ｍＬ　ＥＧＦ　的ＤＭＥＭ．Ｆ１２培养基；重悬浮，２００目细胞筛过滤后　

接种于培养瓶中（１　Ｘ　１０　／Ｌ）；置于３７　ｏＣ　５％ＣＯ，

　山东医药２０１２年第５２卷第２期　

培养箱中培养，每３—４　ｄ更换培养液。３　ｄ后培养　

瓶中可以观察到含有１０余个细胞的细胞团，１周后　细胞团逐渐长成为典型的神经球，２周后培养瓶内　可见大量神经球。　

１．２．２　神经干细胞的鉴定　①ｎｅｓｔｉｎ免疫荧光染　

色：培养１周后，取神经球以冷丙酮固定１０　ｍｉｎ，滴　

在载玻片上烘干；０．０１　ｍｏｌ／Ｌ　ＰＢＳ漂洗３次，５％　ＢＳＡ封闭１５　ｍｉｎ；弃去血清，滴加ｎｅｓｔｉｎ兔抗鼠单克　

隆抗体，以ＰＢＳ代替一抗作为对照，４℃过夜。０．Ｏ１　ｍｏｌ／Ｌ　ＰＢＳ漂洗３次，滴加５　ｇ／ｍＬ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ＠　

４８８羊抗兔荧光二抗，避光室温孵育１２　ｈ。ＰＢＳ漂　洗３次，甘油封片，荧光显微镜下观察照相。神经球　

所含细胞胞质显示绿色荧光，即为ｎｅｓｔｉｎ表达阳性。　②诱导分化：取神经球尽量吹打分散成单细胞，将神　

经干细胞悬液加入预先已置人玻璃盖片的６孔培养　板中，加入１０％胎牛血清。３　ｄ后取出盖片，分别以　

ＮＳＥ、ＧＦＡＰ、ＭＢＰ抗体标记，ＰＩ标记细胞核，常规方　

法行免疫荧光染色。细胞胞质显示绿色荧光为　ＮＳＥ、ＧＦＡＰ、ＭＢＰ表达阳性，表明培养出的神经球具　

备分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的　能力，是神经干细胞。　

１．２．３神经干细胞分化形成星形胶质细胞的观察　取神经球尽量吹打分散成单细胞，将神经干细胞　

悬液加入预先已置入玻璃盖片的６孔培养板中，加　

入１０％胎牛血清。１～７　ｄ每天取出盖片，进行　ＧＦＡＰ荧光标记，ＰＩ标记细胞核。荧光显微镜下观　

察照相，细胞胞质显示绿色荧光为ＧＦＡＰ阳性。计　数阳性细胞数和总细胞数，观察星形胶质细胞的形　

态并分类，计算星形胶质细胞各亚型的比率。　２结果　大鼠神经干细胞分化第７天，ＧＦＡＰ阳性细胞　

比率为６４．３％±３．３１％，可观察到４种形态显著不　同的星形胶质细胞。胞体延长型胞体延长，细胞突　

起明显，分支较少或没有分支，占ＧＦＡＰ阳性细胞的　２．３９％±０．１３％；扁平多角形胞体扁平，呈多角形，　

胞体巨大，可以是其他类型星形胶质细胞数倍大小，　没有或很少有突起，占ＧＦＡＰ阳性细胞的５２．３３％±　

２．０１％；星形具有较小的细胞体，星状的突起分支多　

而明显，占ＧＦＡＰ阳性细胞的５９．８８％±３．１２％；双　极型细胞，两侧各有一细长突起，没有分支，占　

ＧＦＡＰ阳性细胞的５．３９％±０．２７％。　

３讨论　脊髓损伤后星形胶质细胞形成的瘢痕，曾被认　

为是轴突再生不可逾越的屏障；然而有学者在脊髓　损伤的动物模型中去除活化的星形胶质细咆、抑制　瘢痕形成后，却发现脊髓损伤区大量炎性细胞浸润，　

血脑屏障无法修复，神经元和少突胶质细胞丢失，神　经功能恢复更差¨Ｊ。在体外培养实验中，星形胶质　

细胞可以促进神经元的轴突生长＿２　Ｊ。因此，现在认　

为星形胶质细胞形成的胶质瘢痕具有阻碍轴突穿越　和分泌神经营养因子促进轴突再生的双重作用　。　

传统观点认为，星形胶质细胞依其分布及结构　分为纤维型、原浆型两种：①纤维型星形胶质细胞：　

形成连续的胶质鞘一血管围绕界膜，主要位于脊髓　白质，与代谢物的转运及损伤组织瘢痕形成有关；②　

原浆型星形胶质细胞：有众多粗的分支，与神经元密　切相关，并部分包被神经元，主要位于脊髓灰质，可　

能作为神经细胞代谢中问媒介物。但这种分类法过　于简单，星形胶质细胞不论在形态、受体的分布及胞　

质活性物的含量等方面都存在明显的异质性。有研　究　发现，人脑内特定的区域内可以有９种不同形　

态的星形胶质细胞共存。Ｍｉｌｌｅｒ等　体外培养大鼠　

脊髓的星形胶质细胞，发现有胞体延长型、扁平多角　形、星形、小圆饼型、大圆饼型和双极型６种形态。　

研究　发现，不同类型和来源的星形胶质细胞具有　不同的功能。Ｓｏｎｇ等＂　研究表明，只有来自成人海　

马的星形胶质细胞才可以诱导未分化细胞转变成神　

经元，即调节神经元的发生。国内学者　发现，扁　平多角的星形胶质细胞比发出星状突起的星形胶质　

细胞更有利于神经干细胞向神经元分化。目前，仍　不清楚不同亚型的星形胶质细胞在中枢神经系统损　

伤后发挥何种作用。　

神经干细胞移植是目前治疗脊髓损伤最有前途　的方案之一，其原理之一是神经干细胞分化的终末　

细胞能够替代脊髓损伤后局部所有丢失的细胞类　型。有报道　显示，神经干细胞植入损伤的中枢　

神经系统后，主要分化成星形胶质细胞和少量的神　

经元或少突胶质细胞。神经干细胞分化后是否能形　成所有亚型的星形胶质细胞目前未见报道。本研究　

表明，大鼠脊髓来源的神经干细胞在体外能够分化　成４种形态类型的星形胶质细胞，分别对应于Ｍｉｌｌｅｒ　

研究中的胞体延长型、扁平多角形、星形和双极型，　未观察到小圆饼型、大圆饼型。为确保实验的可重　

复性，减少干扰因素，撤除有丝分裂原后，神经干细　

胞的促分化因素只有胎牛血清。既往研究已证实，　胎牛血清可促进神经干细胞分化为成熟的星形胶质　

细胞。因此，脊髓来源的神经干细胞能够分化成大　

多数脊髓中含有的星形胶质细胞类型。实验中没有　观察到圆饼型细胞，原因尚不清楚，可能是由于成体　

干细胞不具备分化成该种星形胶质细胞的能力，也　

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