江西中医药大学学报２０ １ ４年６月第２６卷第３期 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＪＩＡＮＧＸＩ ＵＮＷＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＴＣＭ ２０１４ Ｖｏ１．２６ Ｎｏ．３
间呈现不同趋势。结论：ＣＣＩ 诱导的慢性肝损伤模型复制稳定、病理特征明显，更有利于用于考察药物的作用及机制。 关键词：四氯化碳；肝损伤；组织学 中图分类号：Ｒ２８５．５ 文献标识码：Ａ
Ｍｏｄｅｌ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ Ｍｉｃｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＣＣＩ４ ＸＵ ＰｅＩｌｇ，ＴＡＮ Ｗｅｉ—ｆｅｎｇ，ＬＩＵ Ｂｏ，ＸＩＥ Ｚｈｅｎ，ＣＡＯ Ｙｉ，ＺＨＯＵ Ｎｉａｎ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｊｉａｎｇｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆＴＣＭ，Ｎａｎｃｈａｎｇ ３３０００４，Ｃｈｉｎａ．
肝 给 可 不 可 显 度
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ ｔｈｅ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ ａｍｏｎｇ ａｃｕｔｅ、ｓｕｂａｃｕｔｅ、ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｉｖｅｒ ｉｎｊｕｒｙ ｏｆ ｍｉｃｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＣＣ１４，ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ａ ｓｔａ－ ｂｌｅ、ｒｅｌｉａｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｃｒｅａｔｅ ａ ｌｉｖｅｒ ｉｎｊｕｒｙ ｍｏｄｅｌ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｖｅｒ ｉｎｊｕｒｙ ｗａｓ ｍａｄｅ ｂｙ ＣＣ１４ ｏｉｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓｕｂｃｕ— ｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｒ ｂｙ ｇａｖａｇｅ，ａｎｄ ｆｉｘｅｄ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｉｍｅ．Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ＡＬＴ、ＡＳＴ ａｎｄ ｌｉｖｅｒ ｓｌｉｃｅｓ，ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＡＵ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＣＣ１４ Ｃａｌｌ ｐｒｏｄｕｃｅ ａｃｕｔｅｓｕｂａｃｕｔｅ，ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｉｖｅｒ ｉｎｊｕｒｙ，ａｎｄ ｉｎ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｌｉｖｅｒ ｉｎｊｕｒｙ，ＡＬＴ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ，ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＡＳＴ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｏｎｌｙ ｉｎ ｈｉｇｈ ｄｏｓｅ ｇｒｏｕｐｓ．Ａｓ ｆｏｒ ｓｕｂａｃｕｔｅ ｌｉｖｅｒ ｉｎｊｕｒｙ，ｍｉｄｄｌｅ ｄｏｓｅ ｃａｎ ｉｎｅｒｅａｓｅ ｂｏｔｈ ＡＬＴ ａｎｄ ＡＳＴ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ．Ｃｏｎｃｅｒｎｉｎｇ ｔｈｅ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｉｖｅｒ ｉｎｊｕｒｙ． ｐｌａｓｍａ ＡＩ ａｎｄ ＡＳＴ ｉｎ ａｌｌ ｄｏｓｅ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｍａｒｋｅｄｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｉｎ ａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｎｎｅｒＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｉｖｅｒ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＣＣ１４，ｗａｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｓｔａｂｌｅ，ａｎｄ ｅｌｉｎｉｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｗｅｒｅ ｏｂｖｉｏｕｓ．ＳＯ ｉｔ ｗａｓ ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｒｏｌｅｓ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｄｒｕｇｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃａｒｂｏｎ ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ；Ｌｉｖｅｒ ｉｎｊｕｒｙ；Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ
复制合适的稳定的肝损伤动物模型是寻找肝损 伤治疗药物的前提。目前对于肝损伤模型主要由化
基金项目：国家自然科学基金项目（８１１６０３８９）。 作者简介：徐彭，教授，博士生导师。研究方向：中药防治肝损伤。Ｔｅｌ：（０７９１）８７１１７１５２，Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｐ０４２０＠１６３．ｃｏｒｎ。 通信作者：刘波，博士，副教授，硕士生导师。研究方向：中药防治肝损伤、骨质疏松症。Ｅ—ｍａｉｌ：ｂｏｚｈｒｌｉｕ＠１６３．ｃ０ｍ。
６６· 学性、免疫性、药物、酒精等物质诱导产生¨ 。四 氯化碳（ｃａｒｂｏｎ ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ，ＣＣ１ ）是常见的外源性 化合物 ］，能产生肝损伤并被用于研究药物的防治 作用。兰凤英等 以０．２％的ＣＣ１ 油溶液复制小鼠 急性肝损伤模型，发现郁金能抗ＣＣ１ 致小鼠急性肝 损伤的作用。宁康健等ｌ５ 采用０．１％ＣＣ１ 油溶液复 制小鼠肝损伤模型研究黄芩苷对小鼠肝损伤的保护 研究。此外，也有学者以不同浓度的ＣＣ１ 复制出小 鼠肝损伤模型用于保肝药的研究 ， 。但是，由于 复制动物模型所用ＣＣ１ 油溶液的浓度、药方式和给 药时间不同，导致小鼠肝损伤类型不同，表现多种多 样，缺乏稳定性。因此，选择稳定、有效的ＣＣ１ 致小 鼠肝损伤模型的复制方法是开展实验研究的重要基 础。 １材料与方法 １．１ 材料 １．１．１ 实验动物 昆明种小鼠１２０只，雌雄各半， ＳＰＦ级，体重１８—２２ｇ，购自湖南斯莱克景达实验动 物有限公司，许可证编号：ＳＣＸＫ（湘）２０１１—０００３。 １．１．２ 药物与试剂 ＡＳＴ、ＡＬＴ检测试剂盒（南京 建成生物工程研究所，批号分别为２０１２０７１９和 ２０１２０７１９）；ＣＣ１ 溶液（汕头市陇西化工厂有限公 司，许可证编号：ＸＫ１３—２０１—００１５３）；金龙鱼特香 花生油（江西省南昌市新建县欧尚超市，商品编号 １００５７０３８８２）。 １．１．３ 实验仪器ｕＶ一２１０２Ｃ型紫外可见分光光 度计（尤尼科上海仪器有限公司），超声波清洗器 ＳＫ５２００ＬＨ（上海科导），ＢＳ１２４Ｓ分析天平（Ｓａｒｔｏｒｉ— ＵＳ），ＹＰ２０２Ｎ电子天平（上海精密仪器有限公司）， 手动转轮切片机（Ｌｅｉｃａ），Ｈ一２数显恒温水浴锅（国 华电器有限公司）。 １．２ 方法 １．２．１腹腔注射给药诱导小鼠肝损伤 健康昆明 小鼠４０只，随机分成４组，即正常组、ＣＣ１ 高剂量 组、ＣＣ１ 中剂量组、ＣＣＩ 低剂量组。采用腹腔注射 的方式，分别注射生理盐水、１１ ｍＬ／ｋｇ、１０ ｍＬ／ｋｇ和 ９ ｍＬ／ｋｇ的１％ＣＣ１ 油溶液（油为食用植物油），给 药２４ ｈ。 １．２．２皮下注射给药诱导小鼠肝损伤 健康昆明 小鼠４０只，随机分成４组，即正常组、ＣＣ１ 高剂量 组、ＣＣ１ 中剂量组、ＣＣ１ 低剂量组。采用皮下注射 的方式，分别注射生理盐水、１１ ｍＬ／ｋｇ、１０ ｍＬ／ｋｇ和 ９ ｍＬ／ｋｇ的０．２％ＣＣ１ 油溶液（油为食用植物油）， 隔天给药，连续给药１４ ｄ。 １．２．３ 灌胃给药诱导小鼠肝损伤 实验取雌雄各 徐彭等：四氯化碳诱导的小鼠肝损伤模型比较 半、体重１８～２２ ｇ健康昆明小鼠４０只，饲养一周 后，随机分成雌雄各半４组，即正常组、ＣＣ１ 高剂量 组、ＣＣ１ 中剂量组、ＣＣ１ 低剂量组。采用灌胃给药 方式，分别灌胃蒸馏水、１１ ｍＬ／ｋｇ、１０ ｍＬ／ｋｇ和９ ｍＬ／ｋｇ的０．２％ＣＣ１ 油溶液（油为食用植物油），每 隔４８小时给药，连续给药９０ ｄ。 １．２．４血清ＡＳＴ、ＡＬＴ活性检测 分别在２４ ｈ、１４ ｄ、９０ ｄ时，眼眶取血，并离心获取血清，采用比色法 测定谷草转氨酶（ＡＳＴ）、谷丙转氨酶（ＡＬＴ）（所有步 骤均按照试剂盒说明书进行）。 １．２．５ 肝组织病理学检查分别在２４ ｈ、１４ ｄ、９０ ｄ 时，脱颈处死动物，取肝脏，并以１０％多聚甲醛固定 肝脏组织，常规石蜡包埋，经过８０％、９０％、９５％、 １００％各种浓度乙醇脱水透明后进行石蜡包埋，常规 切片，片厚４１．￣ｍ。铺片和烘片后用二甲苯脱蜡，脱 苯、复水、染色、脱水、透明、封固。二甲苯浸泡２次 各５ｍｉｎ，然后逐层乙醇复水：无水乙醇Ｉ ２ｍｉｎ，无水 乙醇ＩＩ ２ｍｉｎ，９５％乙醇Ｉ ２ｍｉｎ，９５％乙醇ＩＩ ２ｍｉｎ， ８０％乙醇２ｍｉｎ，７５％乙醇２ｒａｉｎ。蒸馏水洗１ｍｉｎ接 着苏木素染色５ｍｉｎ然后自来水轻轻冲洗１ｍｉｎ反 蓝，１％盐酸乙醇分化３０ｓ，自来水浸泡７ｍｉｎ；放置伊 红液中２ｍｉｎ，无水乙醇Ｉ２ｍｉｎ，无水乙醇ＩＩ２ｍｉｎ，二 甲苯Ｉ４ｍｉｎ，二甲苯ＩＩ４ｍｉｎ。待切片干后，透明，中性 树胶封片，光学显微镜下观察各组小鼠肝脏病理学 形态变化。 １．２．６数据处理实验数据均采用面．４－ｓ表示。用 ＳＰＳＳ１３．０软件包进行统计分析，多组间均数比较采 用Ｏｎｅ—ｗａｙ ＡＮＯＶＡ分析。 ２结果 ２．１ 腹腔注射诱导急性肝损伤动物模型的复制 表１ 不同浓度的ＣＣ１ 腹腔注射对肝组织操作的影响
注：与正常组相比， Ｐ＜０．０５，一Ｐ＜０．Ｏｌ，以下均同。 表２不同浓度的ＣＣ１ 皮下注射对肝组织损伤的影响
６７· 由表１可见，不同浓度的ｃｃＬ腹腔注射均可产 江西中医药大学学报２０１４年６月第２６卷第３期 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＪＩＡＮＧＸＩ ＵＮＩＶＥＲＳＩＩＴＯＦ ＴＣＭ ２０１４ Ｖｏ１．２６ Ｎｏ．３
２．Ｍａｔｅｒｎａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｙｉｃｈｕｎ ｃｉｔｙ Ｙｕａｎｚｈｏｕ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｙｉｃｈｕｎ ３３６０００，Ｃｈｉｎａ． Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｍｅｔｈｏｄ，４ ｋｅｙ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｅｒｅ：ｗａｔｅｒ ｏｉｌ ｅｍｕｌｓｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｔｏｓａｎ ａｎｄ ｆｅｒｒｏｆｅｒｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｗｅｉｇｈｔ ｒａｔｉｏ，ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ，ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ ａｎｄ ｅｍｕｌｓｉｏｎ ｒａｔｉｏ．Ｂｙ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｌｌａｎｏ— ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：Ｃｈｉｔｏｓａｎ ａｎｄ ｆｅｒｒｏｆｅｒｒｉｅ ｏｘｉｄｅ ｗｅｉｇｈｔ ｒａｔｉｏ ｏｆ １：１，ｅｍｕｌ－ ｓｉｆｔｅｒ ｄｏｓａｇｅ ｉｓ ０．６ｍＬ，ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ ４ｍＬ，ａｑｕｅｏｕｓ ｐｈａｓｅ ａｎｄ ｏｉｌ ｐｈａｓｅ ｖｏｌｕｍｅ ｒａｔｉｏ ｉｓ ２０：３５．Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｅｈｉｔｏｓａｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｅｌｅｓ ｗｉｔｈ ａｎ ａｖｅｒａｇｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ ａｂｏｕｔ ５０ｎｍ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ Ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ，ｎａｎｏ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｅｖｅｎｌｙ，ｈａｓ ａ－ ｃｈｉｅｖｅｄ ａ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃｈｉｔｏｓａｎ；Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ；Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ