●噙国
Ｈｅｍｉｎ对缺氧缺血性脑损伤新生鼠脑保护作用的研究
黄海波殷小成 杨彩云 易 璐
（南华大学第一附属医院，湖南衡阳４２１００１）
【摘要】目的观察氯化高铁血红素（Ｉｑｅｍｉ￣）对缺氧缺血性脑损伤（ＨＩＢＤ）新生大鼠脑组织中脑红蛋白
（Ｎ ）表达的影响，探讨Ｈｅｍｉｎ的脑保护作用及机制。方法 将７ ｄ龄新生ｓＤ大鼠９０只随机分为假手术组、
ＨＩＢＤ组、ＨＩＢＤ＋Ｈｅｍｉｎ组共３组。采用结扎左颈总动脉、低氧诱导（８％氧气，３２℃）２ ｈ方法建立ＨＩＢＤ模型。
ＨＩＢＤ建模后２ ｈ，ＨＩＢＤ＋Ｈｅｍｉｎ组腹腔注射Ｈｅｍｉｎ（５０ ｍｇ／ｋｇ），假手术组与ＨＩＢＤ组腹腔注射生理盐水。２４ ｈ
后处死取脑，分别行脑梗死体积百分比测定、荧光定量（ＲＴ—ＰＣＩ￣）检测Ｎ ｍＲ＿ＮＡ表达、免疫组化分析Ｎｇｂ
表达。结果ＨＩＢＤ组和ＨＩＢＤ＋Ｈｅｍｉｎ组脑梗死体积百分比、Ｎｇｂ ｍＲＮＡ和Ｎｇｂ表达均较假手术组显著上升
（ ０．０１）；与ＨＩＢＤ组比较，ＨＩＢＤ＋Ｈｅｍｉｎ组ＮｇｂｍＲＮＡ和Ｎｇｂ表达均增加，而脑梗死体积百分比明显减少，
差异均具有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。结论Ｈｅｍｉｎ可减轻新生鼠的缺氧缺血性脑损伤，其机制可能是通过上调
Ｎｇｂ的表达发挥作用。 【关键词】大鼠 缺氧缺血性脑损伤 氯化高铁血红素 脑红蛋白
Ｓｔｕｄｙ Ｏｉｌ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆＨｅｍｉｎ ｏｎ ｈｙｐｏｘｉｃ－ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｂｒａｉｎ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｎｅｏｎａｔａｌ ｒａｔｓ Ｈｕａｎｇ Ｈａｉｂｏ，Ｙｉｎ Ｘｉａｏｃｈｅｎｇ，Ｙａｎｇ Ｃａｉｙｕｎ，ｅｔ ｏ１．Ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｎａｈｕａ Ｕｎｉｖｅｒｓ ，Ｈｅｎｇｙａｎｇ，
Ｈｕｎａｎ ４２ｌｏ０ｌ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｈｅｍｉｎ ｏｎ ｎｅｕｒｏｇｌｏｂｉｎ（Ｎｓｂ）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｎｅｏｎａｔｅ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ
ｈｙｐｏｘｉｃ－ｉｓｅｈｅｍｉｅ ｂｒａｉｎ ｄａｍａｇｅ，ａｎｄ ｔＯ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｅｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｈｅｒｏｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｎｆｆｔｅｔｙ
ｎｅｏｎａｔｅ ＳＤ ｒａｔｓ ｏｆ ７一ｄａｙ—０１ｄ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ３ ｇｒｏｕｐｓ ｒａｎｄｏｍｌｙ，ｉｎｃｌｏｕｄｉｎｇ ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ，ｈｙｐｏｘｉｃ－ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｂｒａｉｎ ｄａｍａｇｅ ｇｒｏｕｐ（ＨＩＢＤ ｇｒｏｕｐ），ＨＩＢＤ ｐｌｕｓ Ｈｅｍｉｎ ｇｒｏｕｐ（ＨＩＢＤ＋Ｈｅｍｉｎ ｇｒｏｕｐ）．Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｏｆｔｈｅ ｌｅｆｔ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ， ａｎｄ ｈｙｐｏｘｉａ－ｉｎｄｕｅｉｂｌｅ（８％ｏｘｙｇｅｎ，３２℃）２ ｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ＨＩＢＤ ｍｏｄｅ１．Ａｆｔｅｒ ２ ｈｏｕｒｓ ｏｆ ＨＩＢＤ ｍｏｄｅｌ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ，ｔｈｅ ｒａｔｓ ｏｆ ＨＩＢＤ＋Ｈｅｍｉｎ ｇｒｏｕｐ Ｗｉｌｔｓ ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｅｄ Ｈｅｍｉｎ（５０ ｍｇ／ｋｇ）；ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ＨＩＢＤ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ
ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｎｏｒｍａｌ ｓａｌｉｎｅ．Ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｋｉｌｌｅｄ ａｔ ２４ｈ ａｆｔｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ．Ｂｒａｉｎ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｆａｒｃｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｖｏｌｕｍｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ，Ｎｓｂ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ ａｎｄ Ｎｓｂ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｅｒｅ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｉｎｆａｒｃｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｖｏｌｕｍｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ，ｔＩｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｎｇｂ ｍＲＮＡ ａｎｄ Ｎｇｂ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ （尸ｌ＜０．Ｏ１）；Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ＨＩＢＤ ｇｒｏｕｐ，Ｎｇｂ ｍＲＮＡ ａｎｄ Ｎｓｂ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＨＩＢＤ＋Ｈｅｍｉｎ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５），ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｉｎｆａｒｃｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｖｏｌｕｍｅ
ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ Ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｃａｎｔｌｙ ｒｅｄｕｃｅｄ（ ＜０．０５）。Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｈｅｍｉｎ ｈａｓ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｅｃｔｓ ｏｎ ｎｅｏｎａｔｅ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ
ｈｙｐｏｘｉｃ－ｉｓｅｈｅｍｉｃ ｂｒａｉｎ ｄａｍａｇｅ，ｗｈｉｃｈ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｇｌｏｂｉｎ． 【Ｋｅｙ Ｗｏｒｄｓ】Ｒａｔ Ｈｙｐｏｘｉｃ－ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｂｒａｉｎ ｄａｍａｇｅ Ｈｅｍｉｎ Ｎｅｕｒｏｇｌｏｂｉｎ
新生儿缺氧缺血性脑病（ｈｙｐｏｘｉｃ—ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ。 ＨＩＥ）是由于围生期窒息所致的缺氧缺血性脑损伤，是引起新生
儿死亡及儿童伤残的重要原因之一Ｉｔ】。其发病机制十分复杂，迄
今为止尚无较好的防治措施。脑红蛋白（ｎｅｕｒｏｇｌｏｂｉｎ，Ｎｇｂ）是一
种在功能上类似于肌红蛋白的携氧球蛋白，可特异性地为脑供
氧，可能参与了脑对缺氧的保护性反应圆。既往研究多为建立新 生鼠缺氧缺血性脑损伤（ｈｙｐｏｘｉｃ—ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｂｒａｉｎ ｄａｍａｇｅ，ＨＩＢＤ）
模型前采用氯化高铁血红素（Ｈｅｍｉｎ）预处理方法观察其脑保护 作用，而对于ＨＩＢＤ建模后Ｈｅｒｏｉｎ能否上调Ｎｇｂ的报道不多。
本研究拟通过ＨＩＢＤ新生鼠建模后２ ｈ腹腔注射Ｈｅｒｏｉｎ，观察
基金项目：衡阳市科技局基础研究计划项目（２０１１ ３９）
‘通讯作者：殷小成 作者简介：黄海波，女，硕士，主治医师。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｃｖｉｎｌ０８＠ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ 脑组织中Ｎｇｂ的变化，探讨Ｈｅｒｏｉｎ的脑保护作用及可能机制， 为ＨＩＥ的临床防治提供实验依据。
１材料和方法 １．１材料和试剂７ ｄ龄ｓＤ大鼠，体重ｌ２～１５ ｇ，雌雄不
分，由南华大学动物实验中心提供，连同母鼠分笼饲养于标准
动物房。Ｎｓｂ引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合
成，Ｎ异ｂ抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，标准混合气
体（８％氧气＋９２％氮气）由衡阳市特种气体厂提供。 １．２实验方法
１．２．１动物分组及模型制备将７ ｄ龄ＳＤ大鼠９０只随
机分为假手术组、ＨＩＢＤ组、ＨＩＢＤ＋Ｈｅｍｉｎ组共３组。ＨＩＢＤ模型
参照文献唧制作方法：乙醚麻醉后结扎并剪断左颈总动脉，并于
２ ｈ后置于３２℃常压低氧舱内，充以８％氧气＋９２％氮气的混合
气体，１．５Ｌ／ｍｉｎ吸入２ ｈ制成ＨＩＢＤ模型。ＨＩＢＤ模型以复氧１ ｈ 基层医学论坛２０１３年５月第１７卷第１３期 １
６３３ 一腧窗
后固定向结扎血管侧旋转来判断ＨＩＢＤ模型是否复制成功。假
手术组只游离左颈总动脉而不结扎，不进行缺氧处理。
ＨＩＢＤ＋Ｈｅｍｉｎ组于ＨＩＢＤ造模后２ ｈ腹腔注射Ｈｅｍｉｎ（５０ ｍｇ／ｋｇ），
ＨＩＢＤ组和假手术组在同一时间腹腔注射等量生理盐水。造模
或术后２４ ｈ各组随机抽取１０只断头取脑用于行脑梗死体积
百分比测定，再随机抽取１Ｏ只断头取脑做免疫组化检测，每组
剩余ｌ０只断头取脑后用于提取核糖核酸（ＲＮＡ）行荧光定量
（ＲＴ—ＰＣＲ）检测。 １．２．２脑梗死体积百分比测定脑组织放于一２０℃冰箱
冻至适当硬度后，每只脑组织以２ ｍｍ间隔行连续冠状位切片 共３片，放入２％２，３，５，一氧化三苯基四氮唑（ｒＩｆＩ’ｃ）染色，然
后置于４％多聚甲醛缓冲液中固定２４ ｈ后，每只脑组织随机抽
取１张切片用于观察，正常脑组织着深红色，梗死脑组织呈苍
白色。应用ＩＰＰ图像处理软件，计算各层面脑梗死面积及层面
总面积，按公式【（各片正反面梗死面积之和／２）×片厚】，【（各片
正反面总面积之和／２）Ｘ片厚１ Ｘ １００％计算梗死体积占所取脑
组织体积的百分比。
１．２．３ Ｎｇｂ ｍＲＮＡ的ＲＴ－ＰＣＲ检测按照Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司生
产的试剂盒说明，提取脑组织总ＲＮＡ。Ｎｇｂ引物序列为：上游引物
５＇－ＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＣＴＣＴＧＧＡＡＣＡ一３ 。 下 游 引 物
５＇－ＧＣＡＧＣＡＴＣＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＡ一３ ，产物长度１７６ ｂｐ。ＧＡＰＤＨ 作内参引物序列：上游引５＇－ＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＧＧ一３ ，
下游引物５＇－ｃｒＩ’ＣＡＧＴＧ ｒＡＧｃｃＣＡＧＧＡ１ＩＧｃ一３ ，产物长度
５２８ ｂｐ。采用凝胶成像系统分析结果，相对表达量＝目的基
因表达量，内参表达量。
１．２．４脑组织Ｎｇｂ蛋白表达相对含量的检测断头取脑
后脑组织立即置入４％多聚甲醛固定２４ ｈ以上并行浸蜡包埋，
每只脑组织以１ ｍｍ间隔行连续冠状位切片共４片，切片后每
只脑组织随机抽取１张用于检测Ｎｓｂ。采用免疫组化ＳＡＢ法，
ＤＡＢ显色，苏木素轻度复染细胞核，用ＰＢＳ液替换一抗作阴性
对照。以平均阳性染色面积百分比法半定量分析Ｎｇｂ蛋白表
达的部位与强弱。
１．３统计学方法计量资料以均数±标准差（ ±ｓ）表示，
采用方差分析，Ｐ＜０．０５为差异有显著性。
２结果 ２．１ 各组脑梗死体积百分比比较假手术组脑组织中
未出现明显梗死灶，ＨＩＢＤ组、ＨＩＢＤ＋Ｈｅｍｉｎ组均出现了明显
的缺血梗死灶，差异具有显著性（Ｐ＜Ｏ．０１）；与ＨＩＢＤ组比较，
ＨＩＢＤ＋Ｈｅｍｉｎ组脑梗死体积百分比显著下降（Ｐ＜０．０５）。见表１。
表１ 各组大鼠脑梗死体积百分比比较
注：ＨＩＢＤ组与假手术组比较，ｑ＝７．４８，Ｐ＜０．０１；ＨＩＢＤ＋Ｈｅｎｉｎ
组与假手术组比较，ｑ＝５．６７，Ｐ＜Ｏ．０１；ＨＩＢＤ＋Ｈｅｎｉｎ组与ＨＩＢＤ组 比较，ｑ＝２．９８，Ｐ＜Ｏ．０５；
２．２各组脑组织Ｎｇｂ ｍＲＮＡ水平比较与假手术组比较，
ＨＩＢＤ组、ＨＩＢＤ＋Ｈｅｍｉｎ组Ｎｇｂ ｍＲＮＡ表达显著上升（尸ｌ＜０．０１），其
中ＨＩＢＤ＋Ｈｅｍｉｎ组ＮｇｂｍＲＮＡ表达量最多。见表２、图１、图２。 表２各组大鼠脑组织Ｎｇｂ ｍＲＮＡ水平比较
注：ＨＩＢＤ组与假手术组比较，ｑ＝９．２４，Ｐ＜Ｏ．０１；ＨＩＢＤ＋Ｈｅｎｉｎ
组与假手术组比较，ｑ＝７．１９。Ｐ＜Ｏ．Ｏ１；ＨＩＢＤ＋Ｈｅｎｉｎ组与ＨＩＢＤ组
比较ｑ＝３．６７．Ｐ＜Ｏ．０５；
稆ｇ ０ ∞０ 瑚 一
Ｍ础甘 手术组ＩｔｌＢＤ组ＩｔＩＥＤ￣Ｉ＇Ｉ￣ｍｍ墟
图１各组脑组织ＮｇｂｍＲＮＡ水平
一
假手术组ＨＩＢＤ组ＨＩＢＤ＋Ｈｅｍｉｎ组 图２假手术组、ＨＩＢＤ组及ＨＩＢＤ＋Ｈｅｍｉｎ组Ｎｇｂ的
蛋白表达（免疫组化ＳＡＢ染色。×４００）
２．３各组脑组织免疫组化Ｎ『 表达水平比较由图２可
见Ｎ 免疫阳性细胞呈棕褐色，主要定位于细胞质。假手术组
有极少量Ｎ 表达，ＨＩＢＤ＋Ｈｅｍｉｎ组Ｎｇｂ表达量最多，ＨＩＢＤ组
次之，差异具有显著性（Ｐ＜０．Ｏ１），见表３。 表３各组大鼠脑组织Ｎｇｂ水平比较
注：ＨＩＢＤ组与假手术组比较，ｑ－－７．５６，Ｐ＜Ｏ．０１；ＨＩＢＤ＋Ｈｅｎｉｎ
组与假手术组比较ｑ＝６．０１，Ｐ＜０．０１；ＨＩＢＤ＋Ｈｅｎｉｎ组与ＨＩＢＤ组 比较ｑ＝３．１３。Ｐ＜０．０５；
３讨论 ＨＩＥ是足月新生儿脑损伤、死亡和伤残的最常见原因，轻
症预后较好，重者于新生儿早期即可死亡，或造成不可逆的脑
损伤。因此，如何有效地降低病死率和致残率及寻找有效的治
疗ＨＩＥ的神经保护药物，成为多数学者研究的重点。
Ｈｅｍｉｎ是一种可诱导血红蛋白和其他红细胞系统特异蛋
白激酶的基因转录、翻译，并提供铁和血红素以合成血红蛋白
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７卷第１３期