第４４卷第ｌ期厦门大学学报（自然科学版）

Ｖ０１．４４Ｎｏ．１

２００５年１月Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ

Ｘｉａｍｅｎ

Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ）Ｊａｎ．２００５

高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究

徐昶１，龙敏南¨，邬小兵１，徐惠娟１，陈重安２，张凤章１，许良树，

（１．厦门大学生命科学学院。微生物与海洋药物研究所．福建厦门３６１００５；

２．厦门市海沧污水处理厂，福建厦门３６１０２６）

摘要：从霉变的玉米芯中筛选到一株高产纤维索酶的菌株，经１８ＳｒＲＮＡ基因序列分析和菌株形态特性分析．确定该菌

株为灰绿曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｇｌａｕｃｕｓ）．利用圆体纤曲培养产生纤维素酶，研究了培养基起始ｐＨ值、培养温度、培养时间、接

种量、氮源、稻草粉与麸皮比例、表面活性剂等对菌株产酶的影响．在最适条件下菌株培养７２ｈ后。羧甲基纤维素酶（ＣＭ．

Ｃａｓｅ）活力高达６８１２Ｕ／ｇ（干曲．下同），滤纸酶活力（ＦＰＡ）达１７２

ｕ／ｇ．利用该菌株对蔗渣进行分解．其糖化率达３６。４％．

关键词：灰绿曲霉；纤维素酶活力ｌ糖化

中图分类号：Ｑ

９３５文献标识码：Ａ文章编号：０４３８—０４７９（２００５）０１—０１０７—０５

纤维素类物质是自然界中最丰富的一种可再生资

源．全球每年光合作用产生的植物生物量高达１．１４×

１０１２ｔ，我国的纤维类资源极为丰富，仅秸秆和皮壳每

年可达７×１０８ｔ．这些原料大部分被烧掉，既破坏了生

态平衡，又污染环境，且能量利用率低（１０％左右）［１］．

如将天然纤维素降解为可利用的糖液，再进一步转化

为酒精、菌体蛋白、气体燃料（如氢气）等物质，对解决

当今世界所面临的粮食短缺、能源危机和环境污染问

题具有深远的意义［２］．纤维素类物质的糖化有酸解法

和酶解法等．酶解法由于能耗低，反应条件温和以及不

使用有毒和腐蚀性的化学物质而倍受青睐［３］．然而至

今未能应用木质纤维素作为工业酶解发酵的原料，纤

维素酶活力不高而导致酶用量过大是限制其应用的主

要因素之一［‘］．因此，筛选酶活高的野生菌株，对纤维

类资源的利用具有重要意义．我们分离到一株具有高

酶活力的灰绿曲霉ＸＣ９，并对其产酶条件和酶解糖化

作用进行了研究．

１材料与方法

１．１培养基

Ｄｕｂｏｓ纤维素培养基，Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ培养基‘日，纤维

素一刚果红培养基‘７・８３；种子培养基：ｌｏ％麸皮浸汁；基

础固体产酶培养基：碱处理稻草粉４ｇ，去淀粉麸皮

牧稿日期：２００３－１Ｚ－０４

基金项目：国家８６３计羽项目（２００１，＇诅５１５０４０）．中匈政府闽科技

合作项目（３５０２７．２００３１１０８）及厦门市科技项目

（３５０２２２００４１０７０）

作者简介：徐昶（１９７３一）－男・硕士研究生．

－Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｌｎｇａｕｔｈｏｒ１ｇ，无机盐培养液１５

ｍＬ（ＫＨ２ＰＯ，４ｇ／Ｌ，

（ＮＨ。）２ＳＯ‘１６ｇ／Ｌ，ＭｇＳ０４１

ｇ／Ｌ）．

１．２菌株的分离筛选

在厦门大学校园附近采集腐枝烂叶、霉变物以及

土样．腐枝烂叶和霉变物捣碎后置于生理盐水中振荡；

土样则配成悬液静置，后取上层水样接入Ｄｕｂｏｓ纤维

素培养基和Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ培养基中，连续富集培养３次，

每次培养至三角烧瓶中的滤纸崩溃为止．将富集后的

菌液在纤维素一剐果红培养基上划线培养（３０℃）至菌

落长出，挑有透明圈的菌落进行复筛，重复几次直至得

到纯菌落．

１．３菌株鉴定

形态鉴定【９］：在平板上挑菌体少许，涂于载玻片

上，置于显微镜下观察．

１８ＳｒＲＮＡ基因分析［１０］：取培养１２ｈ的菌丝体

４ｍＬ，离心去水相，加４００

ｐＬ１％十六烷基三甲基溴

化铵（ＣＴＡＢ），离心后弃上清液，加入细胞裂解液（４

ｍｏｌ／Ｌ盐酸胍，０．１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ７．５）４００

ｐＬ，

室温孵育３０ｒａｉｎ，用酚一氯仿（１：１）和氯仿各抽提一

次，离心取上清液，加２倍体积无水乙醇和１／１０体积

醋酸钠（３ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ５．２）沉淀ＤＮＡ，ＴＥ缓冲液溶解

沉淀后，用１８ＳｒＲＮＡ基因扩增通用引物（５’ＡＴＴＧ—

ＧＡＧＧＧＣＡＡＧＴＣＴＧＧＴＧ３’，５’ＯＣＧＡＴＣ—

ＣＣＴＡＧＴＣＧＧＣＡＴＡＧ３’）进行ＰＣＲ扩增，扩增产物

经纯化后测序（Ｔａｋａｒａ公司）．

１．４粗纤维素酶液的制备

称取湿曲３．６ｇ（相当于１ｇ干曲），加蒸馏水２０

ｍＬ，搅拌均匀，于３０℃恒温水浴ｌｈ，用两层纱布挤

滤，滤液离心（４０００ｒ／ｍｉｎ，１０

ｒａｉｎ，４＂Ｃ），上清液即为

　万方数据’１０８’

厦门大学学报（自然科学版）

２００５年

粗酶液．

１．５酶活力测定方法【１１￣１３］

１）棉花酶活力：取０．５ｍＬ稀释的粗酶液加入到

装有５０

ｍｇ脱脂棉、２ｍＬ醋酸缓冲液（ｐＨ４．８）的带

塞试管中，再加甲苯１滴，加塞后于５０℃水浴２４ｈ．以

每２４ｈ产生１．０ｍｇ还原糖定义为１个酶活力单位

（Ｕ）．

２）羧甲基纤维素酶（ＣＭＣａｓｅ）活力：取２ｍＬ羧甲

基纤维素溶液于试管中，加０．５ｍＬ稀释的粗酶液，混

匀后，于５０℃水浴３０ｍｉｎ．以每３０ｍｉｎ产生１．０ｍｇ

还原糖定义为１个酶活力单位（Ｕ）．

３）滤纸酶（ＦＰＡ）活力：取０．５ｍＬ稀释的粗酶液，

加２ｍＬ醋酸缓冲液和１条滤纸（新华１号，１×６ｃｍ）

于带塞试管中，５０℃水浴１ｈ．以每小时产生１．０

ｍｇ

还原糖定义为１个酶活力单位（Ｕ）．

以在１００℃水浴灭活５ｍｉｎ的粗酶液为对比液，

其余步骤相同．酶活力均指扣除对比液中还原糖后计

算得到的结果．

１．６还原糖测定和全纤维含量测定

分别按文献１－１０］和文献［５］进行．

２结果与分析

２．１筛选结果

本实验中共筛选出４１株能够分解纤维素的菌株，

取其中酶活力较高的４株菌株（编号分别为ＸＣ２，

ＸＣ９，ＸＣｌ５，ＸＣ２３）做进一步分析，以购于中科院微生

物菌种保藏中心的菌株木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ．ｓｐ），康氏

木霉（Ｚ

ｋｏｎｉｎｇｉｉ）作对照．将上述菌株分别接种在刚

果红一纤维素平板上，计算透明圈直径与菌落直径比值

（ＨＣ比值），在基础固体产酶培养基上发酵，然后测纤

维素酶活力，重复３次取平均值，结果见表１．

菌株ＸＣ９由霉变玉米棒上分离得到的，由表１可

表ｉ不同菌株酶活力比较

Ｔａｂ．１

ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｃｅＵｕｌａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｖａｒｉｏｕｓｓｔｒａｉｎｓ

注ｔＵ／ｓ中的质量指千曲见，其ＣＭＣ酶活力、棉花酶活力和滤纸酶活力均高于

其它菌株，故ＸＣ９菌株是纤维素酶活力较高的一个菌

株．

２．２鉴定结果

菌落在ＰＤＡ平板上先以白色絮状扩散，后变为

黄绿色，最终呈铜绿色以点状分散．菌丝具隔膜，含红

色颗粒；分生孢子穗绿色，呈辐射状，分生孢子椭圆形，

表面粗糙；子囊壳球形，黄色；子囊孢子双凸透镜形，赤

道有纹线．该形态特征与灰绿曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ

ｇｌａｕ－

ＣＵ￥）相似．

１８ＳｒＲＮＡ基因片断序列分析结果表明：菌株

ＸＣ９的１８ＳｒＲＮＡ基因序列与灰绿曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ

ｇｌａｕｃｕｓ）１８ＳｒＲＮＡ基因序列同源性高达１００％．

根据以上观察和鉴定结果，初步确定该菌株为灰

绿曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ

ｇｌａｕｃｕｓ）．

２．３灰绿曲霉ＸＣ９产酶条件

１）培养时间与酶活力的关系

将１ｍＬ菌丝体片断悬浮液接种于固体发酵培养

基，３０℃培养，每隔２４ｈ测ＣＭＣａｓｅ和ＦＰＡ酶活力．

结果（图１）表明，在起初的４８ｈ，酶活力增加幅度较

大；当培养到第７２小时，ＣＭＣａｓｅ和ＦＰＡ活力均达到

最大，ＣＭＣａｓｅ达６６１３．１２Ｕ／ｇ干曲，ＦＰＡ活力达

１７１．１２Ｕ／ｇ干曲，４ｄ后酶活力开始下降，第５天的

ＣＭＣａｓｅ和ＦＰＡ活力只有高峰期的５０％左右．因此，

培养时间以３～４ｄ为宜．

２）接种量对酶产量的影响

接种量对酶活力有很大影响．取培养１５ｈ种子培

养液的菌丝体碎片悬浮液０．１５

ｍＬ、０．３ｍＬ、０．６ｍＬ、

０．７５

ｍＬ、０．９ｍＬ、１．２ｍＬ、１．５ｍＬ于固体发酵培养

基中（其接种量体积分数分别为１％、２％、４％、５％、

６％、８％、１０％），培养８４ｈ后测酶活力，结果见图２．

图２表明，接种量为６％时酶活力最高，培养基能

为菌体提供比较充足的营养．接种量过低，营养过剩，

１７５

１５０

１２５

ｌ∞

７５

５０

２５

ｔ／ｄ

图ｌ培养时同对酶活力的影响

Ｆｉｇ．１Ｅｆｆｅｃｔｏｆｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｔｉｍｅ

０１１ｃｅｌｌｕｌａａｅ

ａｃｔｉｖｉｔｙ甚，鼍ｇ臣

咖咖撇蝴啪咖｜咖。目７

６

５

４

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２

ｌ≥葛≯翟譬

　万方数据第１期

徐昶等：高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究．１０９．

０１２

３４

５６７８９１０

Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ

ｑｕａｎｔｉｔｙ／％

图２接种量对酶产量的影响

Ｆｉｇ．２Ｅｆｆｅｃｔｏｆｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ

ｑｕａｎｔｉｔｙｏｎｃｅｌｌｕｌａｓｃ

ａｃ—

ｔｉｖｉｔｙ

菌丝体徒长，产酶滞后；接种量过大，则菌丝体增长迅

速，后期营养不良，且曲温升高，不利于产酶．因此最适

接种量为６％．

３）不同底料与麸皮比对酶活力的影响

本研究以稻草粉为底料．将稻草粉与麸皮以不同

比例混合，按６０Ａ接种量在固体发酵培养基３０＂Ｃ培养

８４ｈ，结果见图３．

图３表明，当稻草粉／麸皮比为４：６时酶活力最

高，ＣＭＣ酶活力比不加麸皮时提高３．６倍，麸皮的量

对ＦＰＡ酶活力影响则更加显著．可见，麸皮对菌种酶

活力的影响是双方面的：一方面为产酶提供必要的营

养因子；另一方面’，其含量增加又会降低培养基的蓬松

程度，使通气量降低，从而影响酶活力．

４）不同氮源对酶活力的影响

采用尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸钠、硝酸铵、蛋白

胨、酵母粉作为氮源（总氮量为０．４％），研究其对酶活

力的影响．以６％接种量３０℃培养８４ｈ，稻草粉／麸皮

比为１：１，实验结果如图４．可知，氮源对酶活力的影

响因素依次为：有机氮＞硝酸盐＞铵盐，采用蛋白胨作

为氮源时效果最好．

５）培养温度对酶活力的影响

将６％菌丝体碎片悬浮液接入固体发酵培养基，

分别于不同温度下培养，每隔２４ｈ测定ＣＭＣ酶活力，

图４不同氮源对酶活力的影响

Ｆｉｇ．４Ｅｆｆｅｃｔｏｆ

ｎｉｔｒｏｇｅｎ８０Ｕｌ佗ｅＯｎｃｅｌｈｌａ．ｅａｃｔｉｖｉｔｙ暑

｛

譬

爱

ｓｔｒａｗ

ｐｏｗｄｅｒ／ｗｈｅａｔｂｒａｎ（ｗ／ｗ）

图３底料与麸皮的比例对酶活力的影响

Ｆｉｇ．３Ｔｈｅｒａｔｉｏｏｆｓｔｒａｗ

ｐｏｗｄｅｒａｎｄｗｈｅａｔｂｒａｎ

ｏｎ

ｃｅｌｌｕｌａｓｅ

ａｃｔｉｖｉｔｙ

总时间为４ｄ．结果表明：灰绿曲霉ＸＣ９在较低温度

（２５℃）下培养，菌体生长缓慢，孢子数量少，呈浅绿色，

酶活力高峰期出现晚．在温度较高（３５℃）时培养，菌体

生长旺盛，孢子多，呈绿色，酶活高峰期出现早，但酶量

偏低．该菌株产酶比较适宜的温度为３０℃．

６）培养基起始ｐＨ值对酶活力的影响

将６％接种量接人起始ｐＨ值不同的固体发酵培

养基，３０℃培养３ｄ，分别测其酶活力．结果表明，灰绿

曲霉ＸＣ９产ＣＭＣａｓｅ最适起始ｐＨ值为５．５，ＦＰＡ最

适起始ｐＨ值为６．０．

７）表面活性荆对酶活力的影响

在固体发酵培养基中加入０．１％～０．８％吐温８０

（ＴＷ－８０）和立白洗衣粉（广东立白集团有限公司产

品），以不加的为对照，培养３ｄ（接种量６％，３０℃），研

究两种表面活性剂对灰绿曲霉ＸＣ９产纤维素酶的影

响．结果表明：加入０．２％～Ｏ．４％的ＴＷ一８０和０．１％

～ｏ．２％的洗衣粉能较大地促进菌体产酶，说明一定浓

度的表面活性剂能提高细胞质膜的通透性。有利于胞

内酶的不断排出．但浓度过高则菌体酶活力降低，可能

菌体受到伤害，使产酶下降，这与文献Ｅ１４３报道的不

同．

２．４灰绿曲霉ＸＣ９粗酶液酶促反应的最适

ｐＨ和最适温度

不同菌株来源的纤维素酶在结构和性质上常有不

同，酶的最适反应条件也往往有些差异．本实验主要研

究了ｐＨ及温度对灰绿曲毒ＸＣ９酶活力影响．

将粗酶液直接与不同ｐＨ值缓冲液配制的一系列

底物５０℃保温，分别测定酶活力，得到ｐＨ对酶活力

影响．实验结果表明：ＣＭＣａｓｅ在ｐＨ４．４＂－－６．０有较高

的酶活力，最适ｐＨ为４．８ＦＰＡ在ｐＨ４．８～６．８酶活

力较高，最适ｐＨ为６．０．

将粗酶液与底物在ｐＨ值为５．０缓冲液中，于不

同温度下直接进行酶促反应。测酶活力，得酶的最适

温度．实验表明ｔＣＭＣａｓｅ和ＦＰＡ最适反应温度均为暑一譬—匠‰

　万方数据