1 分子生物学（下）
1、原核基因调控机制的类型与特点
1.负转录调控：调节基因的产物是阻遏蛋白，起阻止结构基因转录的作用。
(1)负控诱导:阻遏蛋白不与诱导物结合时,结构基因不转录;
(2)负控阻遏:阻遏蛋白与诱导物结合时,结构基因不转录.
2.正转录调控:调节基因的产物是激活蛋白.
(1)正控诱导系统:诱导物的存在是激活蛋白处于活性状态;
(2)正控阻遏系统:诱导物使激活蛋白处于非活性状态.
2、乳糖操纵子和色氨酸操纵子
大肠杆菌乳糖操纵子：乳糖——开动大肠杆菌乳糖操纵子——表达利用乳糖的三个酶——细菌利用乳糖。
乳糖操纵子的控制模型内容
（1）Z、Y、A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码；
（2）该mRNA的启动区（P）位于阻遏基因（I）与操纵区（O）之间，不能单独起始半乳糖苷酶和透过酶基因的高效表达；
（3）操纵区是DNA上的一小段序列（26bp），是阻遏物的结合位点；
（4）当阻遏物与操纵区结合时，Lac mRNA的转录起始受到抑制；
（5）诱导物通过与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵区相结合，激发Lac mRNA的转录。
大肠杆菌色氨酸操纵子：加入色氨酸——阻遏色氨酸操纵子—相关合成酶基因关闭。
色氨酸操纵子与负控阻遏系统
Trp体系参与生物合成而不是降解;
Trp合成分5步,有7个基因参与.
组成包括:阻遏基因（R）、启动区(P)、操纵区（O）、前导区（L）、弱化区（a）和结构基因区；
Trp操纵子的转录调控包括阻遏系统和弱化系统.
3、原核与真核基因表达调控的异同
4、DNA水平的表达调控
染色质的丢失：不可逆
核的全能性（totipotency）：细胞核内保存了个体发育所必需的全部基因
基因扩增(gene amplification)：增加基因的拷贝数
非洲爪蟾卵母细胞rRNA基因卵裂时，扩增2000倍，达1012个核糖体
药物：诱导抗药性基因的扩增；肿瘤细胞：原癌基因拷贝数异常增加
基因重排(gene rearrangement)：将一个基因从远离启动子的地方移到距它很近的位点从而启动转录。如免疫球蛋白基因重排
DNA甲基化(DNA methylation)：
mCpG，即“CpG岛”：在DNA上成串出现，通常被甲基化，极易自发脱氨形成胸3腺嘧啶。
甲基化(methylated)程度高，基因表达降低；
去甲基化(undermethylated)：基因表达增加
DNA甲基化能引起染色体结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式改变——控制基因表达
染色质(chromatin)或染色体(chromosome)结构对基因表达的调控
（1）“开放”型活性染色质结构对转录的影响：转录发生前，染色质在特定区域被解旋松弛，使转录因子与启动区DNA结合——诱导转录。
（2）“灯刷型”染色体上的环形结构与基因的转录活性：两栖类动物卵细胞减数分裂 2 时才能观察到——是最活跃的转录区结构。
DNA甲基化与X染色体失活
雌性胎生哺乳动物细胞中两条X染色体之一在发育早期随机失活
X染色体失活中心(X-chromosome inactivation center,Xic):Xist基因(Xi-specific
transcript)
5、转录水平的表达调控
最重要、最经济的调控方式
顺式作用元件(cis-acting element)
反式作用因子(trans-acting factor)
转录起始的调控
顺式作用元件(cis-acting element)
影响自身基因表达活性的DNA序列
非编码序列
分启动子、增强子、沉默子
启动子
真核基因启动子：由核心启动子和上游启动子两部分组成，是基因转录起始位点（+1）及5’上游大约100-200bp以内的一组具有独特功能的DNA序列，是决定RNA聚合酶II转录起始点和转录频率的关键元件。
核心启动子：保证RNA聚合酶II转录正常起始所必需的最少的DNA序列。包括转录起始点和上游-25-30bp处的TATA盒。
上游启动子元件(upstream promotor elements,UPE)：-75bp处 CAAT 盒（CCAAT）和GC盒（GGGCGG）等，能通过TFIID复合物调节转录起始的频率。
增强子及其对转录的影响
增强子：能使与它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。如SV40上游的两个72bp正相重复序列。
作为基因表达元件，增强子具有的特点：
见教材P257。
呈环状结构，其功能受DNA双螺旋空间构象的影响。
增强子的作用原理
1影响模板附近的DNA双螺旋结构，导致DNA双螺旋结构弯折，活化基因转录；
2将模板固定在细胞核内特定位置，有利于DNA拓扑异构酶改变DNA双螺旋结构的张力，促进RNA聚合酶II在DNA链上的结合和滑动。
3增强子区可作为反式作用因子或RNA聚合酶进入染色体的入口。
感染真核细胞的病毒DNA，大多具有可被寄主细胞蛋白质激活的增强子。
小鼠乳腺瘤病毒（MMTV）的DNA，具有糖皮质激素基因的增强子。在能被类固醇激活的细胞（如乳腺上皮细胞）中，MMTV病毒能旺盛生长。
病毒有寄主范围，因它有组织特异和物种特异的增强子。
沉默子(silencer)
沉默子(silencer)：负性调节元件，起阻遏作用。
反式作用因子(trans-acting factor)
——能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上，参与调控靶基因转录效率的蛋白质。
概念：为DNA结合蛋白，核内蛋白，可使邻近基因开放（正调控）或关闭（负调控）
据转录因子在转录中的作用分为：
（1）通用或基本转录因子(general transcription factors)—RNA聚合酶结合启动子所必需的一组蛋白因子。
TFⅡA、 TFⅡB、 TFⅡD、 TFⅡE等
（2）特异转录因子( special transcription factors)—个别基因转录所必需的转录因子.
OCT-2：在淋巴细胞中特异性表达，识别Ig基因的启动子和增强子。 3 反式作用因子特点
三个功能结构域：DNA识别结合域(DNA-binding domain)；转录活性域(transcriptional
activation domain)；结合其他蛋白的结合域
能识别并结合顺式作用元件(cis-acting element)
正调控与负调控
反式作用因子结构域的模式
DNA结合域(DNA- banding domain)
锌指结构(zinc finger motif)
同源结构域(homodomain,HD) ： 螺旋- 回折- 螺旋(helix-turn-helix)
亮氨酸拉链 结构 (leucine zipper)
螺旋- 环- 螺旋(helix-loop-helix,HLH)
碱性α 螺旋(alkaline α-helix)
反式作用因子结构域的模式
转录活化结构域(transcriptional activation domain)
酸性α-螺旋结构域(acidic α–helix domain):含酸性的螺旋结构,本身特异性诱导转录起始的活性不强,但与通用转录因子结合后,具有稳定转录起始复合物的作用.
富含谷氨酰胺结构域(glutamine-rich domain):富含谷氨酰胺.
富含脯氨酸结构域(proline-rich domain):富含脯氨酸,很难形成α-螺旋.
转录起始的调控
反式作用因子的活性调节
合成后即有活性：需要时合成，可迅速降解
共价修饰：磷酸化-去磷酸化，糖基化
配体结合：如激素与受体的结合
蛋白质与蛋白质相互作用：二聚体
反式作用因子与顺式作用元件的结合
转录起始的调控
反式作用因子的作用方式
成环、扭曲、滑动、Oozing等
反式作用因子的 组合式调控 作用(conbinatorial gene regulation)
使有限的反式作用因子可以调控不同基因的表达
6、癌症基因治疗和HIV
基因治疗
传统治疗：除外科手术以及一些物理治疗方法以外，主要是通过使用药物对人体缺乏的物质进行补充或者通过干预机体的代谢，改善人体的健康状况。
基因治疗：将外源性遗传物质导入目的器官、组织或细胞并显示出相应的生物学效应，从根本上防治疾病的方法。
基因置换：导入正常外源基因，替换疾病基因（同源重组）
基因修正：原位修复致病基因的功能，不一定改变致病基因的核苷酸序列（点突变）
基因修饰：导入有功能的目的基因于病灶或相关细胞，利用目的基因的表达产物补偿疾病基因的功能，但致病基因本身不改变。（广泛使用）
基因抑制：导入外源基因，阻断原有基因表达。（p53抑癌基因的应用）
基因封闭：利用反义核酸阻断有害基因表达。（肿瘤的治疗）
基因治疗研究的基本过程
选择、获取治疗基因
设计基因导入方案
构建基因治疗载体
基因导入
动物模型
培养细胞 4 基因转移（导入）的方法
目前使用的基因转移系统
病毒介导的基因转移
非病毒介导的基因转移
在病毒介导的基因转移系统中以逆转录病毒（70%）和腺病毒用得最为广泛
目前常用的基因治疗方式
间接体内（ex-vivo）法
取组织进行细胞培养
转入目的基因
确定目的基因转入并按要求表达
将改造过的细胞种植或输入体内
体内原位（in situ）法
将目的基因构建于病毒或质粒载体或用脂质体包裹转导入靶细胞
裸DNA直接注射靶组织或靶器官
具体方式：1.病灶部位直接注射；2.腔道内灌注，如注入膀胱、关节腔、胸腹腔、脑室和蛛网膜下腔等；3.器官选择性血管内注入
体内（in vivo）法
像体内注入药物一样，肌注或静脉注射
基因枪轰击
人免疫缺损病毒(HIV)
反转录病毒科,慢病毒属,灵长类免疫缺损病毒亚属.
1983年法国巴斯德研究所Montaginer 和美国国家卫生研究院癌症研究所Gallo等首次证实了HIV是艾滋病的病因.
发现HIV-I(欧美),HIV-II(西非)
HIV病毒粒子的形态结构与传染
直径=100nm
感染T淋巴细胞,也可感染B淋巴细胞和单型核细胞.
HIV感染后可引起明显的病变，形成多核巨细胞，并导致细胞死亡。
HIV基因组及其编码的蛋白
两条正链RNA,每条有9.7Kb.
基因组结构:
5’端帽子结构(m7G5’GmpNp),
5’LTR,
结构蛋白编码区(gag),
蛋白酶编码区(pro),
具有多种酶活性的蛋白编码区(pol),
外膜蛋白(env),3’LTR
HIV膜蛋白主要功能区
gp160是HIV-I的膜蛋白，由845-870个氨基酸组成。
第511位被蛋白酶切后——gp120和gp41。
gp120 有24个糖基化位点，糖基化是与CD4受体结合所必须的。
gp120 gp120的功能区 ：
（1）主要抗原决定簇；（2）T细胞决定簇；（3）CD4受体结合区
HIV的复制
主要侵染人体的T淋巴细胞及巨噬细胞，通过gp120与细胞表面的CD4受体蛋白结合。
病毒核心蛋白与两条RNA链进入细胞。
反转录酶以病毒RNA为模板合成单链DNA，并由宿主细胞DNA聚合酶合成双链DNA。
经环化后进入细胞核并整合到染色体上，随细胞分裂传给子代细胞。
HIV-I基因的表达调控
LTR序列：HIV基因组两端的高度保守序列。5’端LTR含有HIV基因调控所必须的多个特定调控区。