溶菌酶及其应用 环境1101班 11601540110 曾碧玲 摘要：溶菌酶又称胞壁质酶,是一种无毒、无害、安全性很高的高盐基水解蛋白酶,作为天然防腐剂的溶菌酶能选择性地分解微生物及植物细胞壁,而对没有细胞壁的人体细胞不会产生降解作用,因而被广泛应用于医药、食品等行业。本文介绍了溶菌酶的性质，制备及其应用。 关键词：溶菌酶 性质 制备 应用 Abstract:Lysozyme is also called murein enzyme, is a kind of avirulent and harmless, safety, high high base hydrolysis protease, as a natural preservative of lysozyme can selectively decomposition microorganisms and plant cell walls, and for no human cells do not produce degradation of cell walls, and therefore is widely used in medicine, food and other industries. This paper introduces the properties of lysozyme, preparation and its application. Keywords: Lysozyme properties preparation applications 引言：对溶菌酶的研究始于20世纪初, 人们发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶, 因其具有溶菌作用, 故命名为溶菌酶[ 1]。溶菌酶[ Lysozyme ( EC3. 2. 1. 17) ] 又称为胞壁质酶, 是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶, 其化学名称为N- 乙酰胞壁质聚糖水解酶112[ 2]。 1.溶菌酶的性质 溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。 溶菌酶的储存条件为2-8°C，形状为粉末状，颜色是白色，危险品标志为B，安全说明23-24/25-22，WGK Germany3，RTECS号 OL5989850，F3-10。白色或微白色冻干粉，溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活；96℃， pH值为3条件下，15min后活力保持87%。有碘、咪唑和吲哚衍生物、表面活性剂(十二烷基硫酸钠、醇类和碳链不少于12的脂肪酸)。1%水溶液在281.5nm处的吸光系数为26.4，通过水解细菌细胞壁的肽聚糖来溶菌。酶反应为Micrococcus luteus或Micrococcus lysodeikticus菌悬浮液═溶菌并澄清。 溶菌酶是一种无毒、无害, 安全性很高的高盐基蛋白质, 且具有一定的保健作用, 可广泛用于医疗和食品等行业, 还可作为生物工程研究中的工具酶, 提取微生物细胞内各类物质, 以及进行原生质体制备及融合育种。 溶菌酶的分子结构图 2.溶菌酶的生产与制备 以蛋清为原料，在pH6.5条件下用弱酸性阳离子交换树脂732吸附后，再用硫酸铵洗脱，经透析后冷冻干燥得产品。 溶菌酶是采用生物工程技术进行克隆、提取而制取,它是一种天然酶，安全绿色的添加剂，无抗药性。 该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。 溶菌酶在等电点以下较广泛的pH值范围内，分子带正电荷，可吸附于弱酸性阳离子交换树脂上，洗脱后盐析，可得溶菌酶沉淀，再进行精制可得成品。蛋清吸附↓724树脂洗涤↓缓冲液洗脱↓硫酸铵溶液盐析透析去碱性蛋白↓NaOH冻干溶菌酶冻干粉沉淀干燥溶菌酶在5～10℃下，将新鲜蛋清540kg加入到已处理好的80kg 724树脂中，搅拌吸附6h，在0～5℃静置过夜。倾出上层蛋清，树脂离心甩干，用蒸馏水反复洗去黏附的卵蛋白，然后将树脂装入柱内，用0-15mol/L、pH=6?5磷酸缓冲溶液约150L洗涤树脂，再用约600L的10%硫酸铵溶液洗脱，收集洗脱液。洗脱液中加硫酸铵，使最终含硫酸铵量为40%，有白色沉淀生成，冷处放置过夜。虹吸上层清液，沉淀吸滤抽干，再用1倍蒸馏水溶解沉淀呈稀糊状，然后装入透析袋，在约5℃的条件下，对蒸馏水透析24h左右，中间换水2～3次。离心去除沉淀，沉淀再用少量水洗一次，洗液与离心液合并。再往透析清液中慢慢加入1mol/L氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，使pH值上升到8?0～9?0，如有白色沉淀，即离心除去。然后用3mol/L盐酸调pH=5?0，冷冻干燥，即得白色片状溶菌酶。也可将离心液用3mol/L盐酸调pH=3?5，在搅拌下缓慢加入5%的固体氯化钠，在约5℃的温度下静置48h，离心，沉淀用0℃丙酮洗涤，干燥，即得溶菌酶。[ 12] 3.溶菌酶的应用 3.1在食品工业中的应用 溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质, 又具有溶菌作用, 因此可用作食品防腐剂。目前已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐, 溶菌酶属于冷杀菌, 在杀菌防腐过程中不需加热, 因而避免了高温杀菌对食品风味的破坏作用, 尤其对热敏感的物质更具有重要意义[ 3] 。还可以添加到乳粉中, 使牛乳人乳化, 以抑制肠道中腐败微生物的生存, 同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。此外, 还能利用溶菌酶生产酵母浸膏和核酸类调味品。 对于酵母、霉菌和革兰氏阴性菌等引起的腐败变质, 溶菌酶不能起到防腐作用。但溶菌酶有良好的配伍性, 可与其他添加剂( 如同植酸、甘氨酸、聚合磷酸盐等) 复配使用, 从而大大提高其防腐保鲜的效果。 3.2在科研中的应用 在科研上利用溶菌酶专一性水解细胞壁的特点, 可以了解细胞壁的构造; 分解细胞壁后制备的原生质体可用于微生物育种以及微生物分类等学术研究和专用试剂。近年来, 溶菌酶已成为基因工程及细胞工程必不可少的工具酶, 用以制造和提取菌体的活性物质如核酸、酶和活性多肽等[ 4]。 目前, 有关溶菌酶应用的最新研究进展包括以下几个方面: ( 1) 将溶菌酶固定化在食品包装材料上, 生产出有抗菌功效的食品包装材料, 以达到抗菌保鲜功能[ 5]; ( 2) 将溶菌酶固定化在HEPA( 空气过滤器) 上,作为空调的空气净化系统, 使其具有高效除尘和杀菌两大功能。当空气通过滤网时, 先滤集捕捉尘粒和细菌, 然后将捕捉到的细菌杀灭[ 6]。 ( 3) 用溶菌酶非专一性地降解海洋生物高分子壳聚糖, 使其成为能被人体吸收的低分子量的有独特的生理活性和功能性质的低聚壳聚糖[ 7]。 3.3在医学中的应用 3.3.1 溶菌酶在抗菌消炎、增强免疫力方面的应用 溶菌酶对G+ 、枯草杆菌等有很好的杀灭作用, 对大肠杆菌、普通变球菌等G- 也具有一定程度溶解。此外,溶菌酶与抗菌素合用效果更佳, 因而, 溶菌酶广泛应用于医药行业, 如利用溶菌酶治疗各种五官科炎症, 尤其对急性炎症如急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等效果明显[ 8]。 3.3.2 溶菌酶在多种疾病诊断方面的应用 戴清源等[ 9]报道, 正常情况下, 人体尿液中一般只存在少量溶菌酶, 因此测量尿中溶菌酶含量, 有助于检测肾小管功能障碍性疾病。同时, 烧伤病人分泌的溶菌酶比常人多出几倍, 也可在尿液中检出, 有助于对手术移植排斥、烧伤严重程度的判断。此外, 血清中溶菌酶含量高低对白血病的诊断起辅助作用。 此外, 可用溶菌酶来制造眼药水、润喉液等。溶菌酶作为内服剂时, 可抑制流行性感冒和腺病毒的生长, 抗感染及抗炎症, 而且溶菌酶对耐药性细菌同样具有溶菌作用, 且具有疗效显著和对人体副作用小的特点, 因而是一种较为理想的药用酶。[ 10] 3.4在体育领域中的应用 溶菌酶还可以应用在体育领域, 据俄罗斯巴.戈托夫米夫的报道[ 11], 用溶菌酶可以对运动员身体机能进行评定, 他认为, 处于良好状态的运动员其唾液溶菌酶的滴定值高于训练水平不佳的运动员, 训练负荷大, 能使运动员溶菌酶的滴定值下降, 溶菌酶是构成机体非特异性免疫功能的因素之一。在一定程度上能反映机体的免疫能力, 是一项较灵敏的亚临床指标。测定唾液溶菌酶取样属于无损伤方法, 测定方法简单易行, 便于较长时间追综观察, 有助于在训练期和恢复期进行机能评定。 4.结论 当今世界环境污染日趋严重, 在人人倡导绿色食品的今天, 溶菌酶作为一种无毒安全的天然蛋白质, 在食品、医药和生物工程中已有广泛的应用, 工业上对溶菌酶制剂的需求量也是与日俱增。 近年来, 我国也相继开展了一些有关溶菌酶提取和应用方面的研究工作, 但溶菌酶制造业还停留在规模小、设备和生产技术相对落后的阶段。尽管我国对溶菌酶开发应用十分有限, 我们要相信随着科学技术的不断发展和人民生活水平