溶菌酶综述耿红健基础药学基地班09104103溶菌酶分离提纯、纯度鉴定以及活力测定综述耿红健基础药学基地班 0910103溶菌酶简介溶菌酶名称起源于1922 年，Alexander Fleming 发现人的唾液、眼泪中存在一种可溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，就命名为溶菌酶。

此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶马等动物乳汁中，也可以从番木瓜、无花果、大麦、卷心菜等植物中可分离菌酶的存在。

溶菌酶广泛存在于动植物体内和人的外分泌液中，可以从牛、羊、出溶菌酶，其中蛋清溶菌酶含量最丰富，约为0.3%~0.4% 。

溶菌酶是一种碱性球蛋白，其分子由129个氨基酸组成，2200个原子，分子量14388-18000(14388、14500、18000)，等电点为10.7-11.0，分子内有4个二硫键交联，化学性质非常稳定，对热也极为稳定，Sbaharu等报告牛奶中的溶菌酶分子量为18000，一级结构尚未清楚。

人乳中的溶菌酶和a-La的一级结构有74％是相同的。

Ⅱ一La是人乳中含量较多的蛋白质。

它对于乳腺中乳糖的合成是必不可少的．是乳糖合成酶的辅酶。

溶菌酶和d-La在生物学上是同源的，但它们的三级结构有很大的区别。

它可溶解许多细菌的细胞膜．使细胞膜的糖蛋白类多糖发生加水分解作用。

分子中碱性氨基酸、酰氨残基及芳香族氨基酸较高，如色氨酸的比例较高。

酶的活性中心是天门冬氨酸和谷氨酸，溶菌酶通过其肤键中第35位的谷氨酸和第52位的天门冬氨酸构成的活性部位水解破坏组成徽生物细胞壁的N_一乙酰葡萄糖胺与N一乙酰胞壁质酸间的B一(1，4)糖苷键，使菌体细胞壁溶解而起到杀死细菌(尤其是球菌)的目的。

此外，溶菌酶的最适温度为50度，最适Ph为6，溶菌酶具有热稳定性，100摄氏度保持十分钟仍具有活性。

溶菌酶是动物自身的重要免疫因子，是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，又称细胞壁溶解酶。

具有杀菌消炎、抗病毒、增强免疫力、促进有益菌繁殖等作用，并具有对人禽无毒、无药害残留、无副作用等优点。

目前已经被众多领域广泛应用。

水解细菌细胞壁，在细菌形态学观察中表现出很强的溶菌现象。

并可以阻止流感病毒和腺病毒等病毒的繁殖致病，与带负电荷的病毒蛋白直接作用，和DHA、RNA的脱辅基蛋白直接形成复合盐，使病毒失活。

溶解酶还作为机体非特异性免疫因子之一，参与机体多种免疫反应，能提高机体强大抵抗力。

此外，还具有激活血小板机能，改善局部组织血液循环，促进机体损伤组织修复等功能。

主要特点1、具有消炎、溶菌（杀菌），促进机体组织修复和增强机体免疫力等供销，防治效果显著。

从对临床防治来看，平均预防有效率为95%以上。

治疗有效率达85%以上。

综合性能显著优于目前临床上所使用的常用抗生素药物。

2、抗菌谱广。

对金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌和化脓棒状杆菌等致病菌有抑杀作用。

对耐药菌株效果尤佳，不会产生耐药性。

3、具有抗病毒作用：对流感，呼吸道疾病及水生动物中的病毒性疾病有显著的防治效果。

4、与抗生素类药物合并使用时具有增效功能，可适当减少抗生素用量。

5、长期使用能改善肠道的微生态环境。

杀灭有害菌，促进有益菌繁殖，显著提高采食粮；增强消化吸收功能；能明显提高生长速度和饲料利用率，获得很好的经济效益。

溶菌酶本身是属于耐高温的酶，具有高度稳定性，能承受饲料制粒工艺的高温处理几长期储存。

特点功能：1.用于畜禽及水生动物，由球菌、杆菌等细菌引起的黄白痢、肠胃炎等疾病治疗和预防，效果显著。

2.抗病毒，对流感、高热和呼吸道疾病及水生动物中的病毒性疾病都有显著的防治效果。

3.与抗生素类药物合并用药时具有增效功能，可适当减少抗生素的用量，以防止产生耐药菌。

国际酶学委员会根据其底物及作用特点又称其为酰胺酶或粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶，编号E C3.2.1.17，与常见的蛋白酶、淀粉酶一样属水解酶系列。

根据其来源不同一般可将溶菌酶分6 类：C型(chicken)、G型(goose)、无脊椎动物型(invertebrate-type)、噬菌体、细菌和植物来源溶菌酶。

不同来源酶的分子量、氨基酸组成及酶特性各有不同，但三维结构显示来源于共同的进化起源。

目前对C型溶菌酶研究较多，它是由129个氨基酸残基组成的一条多肽链，含有4对二硫键，三维结构为较紧密的椭球形，它广泛存在脊椎动物如哺乳动物、鸟、爬行动物及鱼类和无脊椎动物如昆虫、甲壳类中。

溶菌酶基本理化性质及作用机理：①溶菌酶由129个氨基酸构成的单纯碱性球蛋白,化学性质非常稳定。

当pH值为1.2～11.3范围内剧烈变化时,其结构几乎不变。

在酸性环境中,溶菌酶对热的稳定性很强；当pH值为4～7,100℃处理1 min 仍能保持原酶活性;当pH值为3时能耐100℃加热处理45min;在干燥条件下,溶菌酶可以长期在室温存放,其纯品为白色或微黄色。

黄色的结晶体或无定形粉末,无臭,味甜。

易溶于水,遭碱易破坏,不溶于丙酮和乙醚[5]。

【实验材料】1.实验器材循环水式真空泵 HSB-IⅡ; 蛋白紫外检测仪; 记录仪; 紫外分光光度计; 梯度混合器(500mL); 721型光分光光度计; 冰冻离心机；冰箱；透析袋；酸度计；部分收集器；恒流泵；圆盘电泳装置；恒温水浴锅；层析柱(2.6×50cm)(1.6×30cm)；布氏漏斗(500mL)；吸滤瓶(1000mL)；G-3砂芯漏斗(500mL)2．实验试剂⑴鸡蛋清（鲜鸡蛋）⑵底物微球菌粉⑶ D152大孔弱酸性阳离子交换树脂⑷固体氯化钠（NaCl）；固体硫酸铵(NH4)2SO4；固体磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）；固体磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）；固体磷酸钠（Na3PO4）⑸乙醇；蒸馏水；甲醇；考马斯亮蓝；三氯醋酸；丙酮(6) 溶菌酶标准品；Sephadex G50⑺ N-乙酰葡萄糖胺；硫酸铜；硫酸亚铁；硫酸锌；氯化镁；氯化钙；氢氧化钠；盐酸⑻ SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂（见实验六）；蛋白含量测定（福林法）试剂（见实验二）⑼聚乙二醇-20000、两性电解质【实验操作】1.蛋清的制备将4～5个新鲜的鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清流出（鸡蛋清pH值不得小于8），轻轻搅拌5分钟，使鸡蛋清的稠度均匀，用两层纱布过滤除去脐带块，量体积约为100ml.2.鸡蛋清粗分离按过滤好的蛋清量边缓慢搅拌边加入等体积的去离子水，均匀后在不断搅拌下用1mol/L HCl调pH值至7左右，用脱脂棉过滤收滤液。

3.D152大孔弱酸性阳离子交换树脂层析⑴ D152树脂处理：将D152树脂先用蒸馏水洗去杂物，滤出，用1mol/L NaOH 搅拌浸泡并搅拌4～8小时，抽滤干NaOH, 用蒸馏水洗至近pH7.5, 抽滤干, 再用1mol/L HCl按上述方法处理树脂，直到全部转变成氢型，抽滤干HCl , 用蒸馏水洗致近pH5.5，保持过夜，如果pH之不低于5.0，抽滤干HCl,用2mol/LNaOH 处理树脂使之转变为钠型，pH值不小于 6.5。

吸干溶液，加pH6.5 0.02mol/L 的磷酸盐缓冲液平衡树脂。

⑵装柱：取直径1.6cm，长度为30cm的层析柱，自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液，关闭层柱出口，待树脂沉降后，放出过量的溶液，再加入一些树脂，至树脂沉积至15～20cm高度即可。

于柱子顶部继续加入pH6.5, 0.02mol/L磷酸盐缓冲液平衡树脂，使流出液pH为6.5为止，关闭柱子出口，保持液面高出树脂表面1cm左右。

⑶上柱吸附：将上述蛋清溶液仔细直接加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内，流速为1ml/min。

⑷洗脱：用柱平衡液洗脱杂蛋白，在收集洗脱液的过程中，逐管用紫外分光光度计检验杂蛋白的洗脱情况，当基线开始走平后，改用含 1.0mol/L NaCl 的pH值6.5，浓度为0.02 mol/L磷酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱液。

⑸聚乙二醇浓缩：将上述洗脱液合并装入透析袋内，置容器中，外面覆以聚乙二醇，容器加盖，酶液中的水份很快就透析膜外的聚乙二醇所吸收。

当浓缩到5mL左右时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇，小心取出浓缩液。

(6) 透析除盐：蒸馏水透析除盐24小时。

4.Sephadex G50分子筛柱层析⑴装柱：先将用20%乙醇保存的Sephadex G50抽滤除去乙醇，用6g/LNaCl 溶液搅拌Sephadex G50数分钟，再抽滤，反复多次直至无醇味为此。

(如果Sephadex G50是新的，则按实验五中的方法处理凝胶)。

加入胶体积1/4的6g/L NaCl溶液，充分搅拌，超声除去气泡，装入玻璃层析柱（1.6×50cm），柱床45cm。

⑵上样：与实验五中的方法相同。

⑶洗脱:样品流完后，先分次加入少量6g/L NaCl洗脱液洗下柱壁上的样品，连接恒流泵，使流速为0.5mL/min，用部分收集器收集，每10分钟一管。

⑷聚乙二醇浓缩：合并活性峰溶液，用聚乙二醇浓缩到5mL左右时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇，小心取出浓缩液。

⑸透析除盐:蒸馏水透析除盐24小时。

收集透析液，量取体积。

5. 溶菌酶活力测定⑴酶液配制：准确称取溶菌酶样品5mg, 用0.1mol/L,pH6.2磷酸缓冲液配成1mg/ml的酶液，再将酶液稀释成50µg/ml.⑵底物配制：取干菌粉5mg加上述缓冲液少许，在乳钵中（或匀浆器中）研磨2分钟，倾出，稀释到15～25ml，此时在光电比色上的吸光度最好在0.5～0.7范围内。

5.3 活力测定：先将酶和底物分别放入25O C恒温水浴预热10分钟，吸取底物悬浮液4mL放入比色杯中，在450nm波长读出吸光度，此为零时读数。

然后吸取样品液0.2mL（相当于10µg酶），每隔30s读1次吸光度，到90s时共计下四个读数。

活力单位的定义是：在25℃，pH6.2，波长为450nm时，每分引起吸光度下降0.001为1个活力单位。

酶的活力单位数=△Anm/t×0.001450比活力=酶的活力单位数/mg蛋白质6.选做实验（1）溶菌酶的热稳定性：取G50峰2的溶菌酶2ml放入恒温水浴槽中，逐步升温，每隔五度测其酶活力。

（2）溶菌酶的最适Ph值：于小试管中加入1mlG50峰2的溶菌酶，并加入等量缓冲液，Ph分别为4、5、6、7、8，同时将底物pH值调整为4、5、6、7、8，底物与酶的pH值一一对应，在50度的条件下测其酶活力。

（3）米氏常数的测定：配置不同浓度的底物，与等量的酶反应（4）等电点的测定等等附：○1蛋白质含量测定方法比较一、Folin-酚试剂法（Lowry法）原理：蛋白质中含有酪氨酸和色氨酸残基，能与Folin-酚试剂起氧化还原反应。

反应过程分为两步，第一步：在碱性溶液中，蛋白质中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成蛋白质-Cu2+复合物；第二部：蛋白质-Cu2+复合物中所含的酪氨酸和色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色化合物。