低氧诱导因子（HIF-1）及相关因子在缺血性卒中的作用

摘要：低氧是脑血管疾病发病过程中一个重要的病理生理因素，尤其在缺血性卒中过程中起着非常重要的作用。低氧是在卒中过程中低氧应答时基因表达和恢复内环境平衡的调节中心。低氧诱导因子（HIF-1）对缺血坏死后新生血管的形成和低氧诱导的细胞凋亡过程都是非常关键的因素。调控低氧诱导因子（HIF-1）水平将为缺血性疾病的治疗开辟新的途径。

关键词：低氧 低氧诱导因子（HIF-1） 卒中

Abstract: low oxygen is cerebrovascular disease process is an important pathophysiological

factors, especially in the process of ischemic stroke plays a very important role. In the process of

low oxygen is low oxygen when answering stroke gene expression and restore the balance in

environmental regulation center. Hypoxia-inducible factor (HIF - 1) for ischemia after the

formation of new blood vessels necrosis with low oxygen apoptosis induced process is very

crucial factors. Control HIF (HIF - 1) level for the treatment of ischemic diseases will open a new

way.

Keywords: low oxygen HIF (HIF - 1) stroke

1992年semenza在人的HEP 3B细胞株的核提取物中发现一种蛋白质，这种蛋白能特异性地结合于红细胞生成物（EPO）基因增强子的寡核苷酸序列，这种蛋白即被命名为低氧诱导因子（HIF-1），随着对其研究的不断深入，在实验中发现其与缺血/低氧状态下机体的各种应答机制关系密切。【1】但目前由于受实验条件等各种原因的限制，低氧诱导因子（HIF-1）在缺血性脑血管卒中的研究中还处于起步阶段。本文即对其和其他相关因子在缺血性脑血管卒中的发病机制中的作用作一概括总结。

1.低氧诱导因子（HIF-1）的结构基础与低氧应答的相关机制

1.1 HIF-1的结构

HIF-1是由一个120KD的a亚单位和一个91-94KD的β亚单位构成，特点是一个异构二聚体，两个亚单位均为碱性螺旋-环-螺旋蛋白，且含有PAS结构域【2】，属于bHLH-PAS超家族的成员。其中HIF-1a是HIF-1的特异性蛋白，HIF-1β是ARNT的基因产物，HIF-1的活性分以下几个层次:HIF-1mRNA表达水平调节，蛋白表达水平调节，HIF-1的二聚化，以及DNA结合活性调节，HIF-1a的转录活性调节。常氧下HIF-1无DNA结合活性，但低氧可诱导HIF-1a蛋白水平和HIF-1DNA结合活性的增加，但HIF-1β不受低氧诱导。

1.2 HIF-1活性的调控

HIF-1和HIF-1a是受细胞氧浓度的精确调节，HIF-1a是HIF-1的活性亚基，又是氧调节亚基。在非低氧条件下HIF-1a被泛素-蛋白酶体所降解，而低氧可使HIF-1a迅速积累，然后与HIF-1β结合，形成二聚体【3，4】。HIF-1β的蛋白表达是非氧依赖性的，可以在细胞内持续表达。此外HIF-1的活性还受多种因子的调节，如白细胞介素1β，肿瘤坏死因子（TNF）,NO等因子的调节。Bergeron等通过对新生大鼠脑缺氧预处理3 h发现,缺氧预处理可明显提高HIF-1α和HIF-1β的表达水平,从而保护新生大鼠脑组织免受缺血/缺氧损伤【】,提示这种脑保护的机制可能是通过缺氧处理后导致脑组织HIF-1表达增高而实现。Ran等在成年大鼠持续性脑局灶缺血前24 h给予正常压力缺氧3 h,可迅速提高HIF的含量及其靶基因EPO、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factors,VEGF)、诱生型一氧化氮合酶(inducible nitrio synthesize enzyme,iNOS)、糖酵解酶的mRNA水平;持续6 h缺氧,24 h后可上调EPO和VEGF在蛋白水平的表达【】。

1 .3 靶基因及其生物学效应

HIF-1可与含有低氧反应元件和顺式作用转录调节序列的靶基因结合,从而激活靶基因的转录。迄今发现HIF - 1的靶基因有几十个，可以诱导多种酶的表达，每种酶分别在器官、组织、细胞水平的低氧适应反应过程中起重要作用：如EPO刺激红细胞再生以提高机体血液携氧能力；转铁蛋白为血红素合成提供铁原料；VEGF 、FLT-1 、ANGII 等影响血管新生。iNOS 、血红素氧合酶( HO1 ) 用于合成NO和CO，从而影响血管紧张度或参与缺血预适应第二窗口期的组织保护作用；Clutl 、Glut3 、LDH- A、 醛缩酶、烯醇化酶、胰岛素样生长因子结合蛋白3 ( IGFBP3 ) 等多种酶可促进糖酵解从而增加ATP产量；凋亡前基因

NiP3【5】影响细胞凋亡因子P53 ；铜蓝蛋白参与应急炎性反应等。

1.4低氧诱导因子（HIF-1a）与脑缺氧损伤

大脑对低氧十分敏感，任何氧浓度降低的情况均可能诱导HIF -1的快速大量表达，

HIF-1a 神经元的出现在时间上要早于神经元形态改变。急性缺氧后4小时开始出现HIF-a

的表达，8小时后逐渐减少，2 4小时后不能检测到。慢性缺养状态下，3～ 4周后出现大量

HI F-1a 缺血再灌注阳性的神经元。在大鼠短暂性全脑缺血模型中，用免疫印迹 ( Western

blot ) 法和免疫细化学分析方法监测发现，缺血15分钟后,大脑皮质和海马有HIF-1

mRNA和VEGF mRNA在同一神经元的表达，在4～7 2小时再灌注期间持续表达【6】。在线栓大脑中动脉( multi-conjugate adaptive optics ，MCAO) 局灶脑缺血模型中发现HIF -1在梗死边缘和扣带区皮质表达，其靶基因也在此区域表达，包括葡萄糖转运体蛋白-1 ( glucose

transporterin-1 ，GLUT -1 ) 、乳酸脱氢酶( 1actate dehydrogenase，LDH) 、磷酸果糖激酶等。梗死区外凡有血流量下降的区域均出现HIF-1 表达，提示脑缺血后 HIF-1a 表达区域可认为是梗死区周围慢性缺氧的区域。可见HIF-1在缺血性卒中过程中起着一定的负反应作用。

2.低氧诱导因子（HIF-1）的脑保护作用机制

2.1 低氧诱导因子（HIF-1）对血管内皮生长因子的生物学调节

VEGF是一种由二硫键连接的、相对分子质量为3 6×1 0 ～ 4 2×1 0的糖蛋白二聚体，

其对缺血再灌注组织的保护作用主要通过以下几个途径：

2.1 .1 促进内皮细胞的增殖和血管的生成VEGF是一种内皮细胞特有的有丝分裂原，

VEGF及其受体在HIF-1的刺激下表达增多。VEGF可以通过其特异性受体Flt -1与 f l k -1

／KDR直接作用于血管内皮细胞刺激其增殖，促使血管形成，改善局部血供。在这里VEGF促进血管生成的方式为血管新生,有别于胚胎发育时的血管发生。VEGF不仅贯穿血管新生的整个过程,而且它还能在内皮细胞中诱导抗凋亡蛋白Bcl -2的表达，抑制凋亡蛋白caspase

-3的表达，维持内皮细胞的生存。此外VEGF还能刺激内皮细胞的迁移，对减轻内皮增厚，

防止血管再狭窄有重要意义 。

2. 1.2 增加血管通透性 VEGF又被称为血管通透因子，它增加血管通透性的作用十分强烈，尤其是微小血管。使血浆大分子外渗沉积在血管外的基质中，为细胞的生长和新生毛细管的建立提供营养。其作用机制为VEGF与 Flt -1受体结合，可使NO产生增加，NO可激活环氧化酶进而可促进前列环素的产生，后者可使血管通透性增加，促进许多血浆蛋白渗出血管外，故有学者认为VEGF可能导致缺血再灌注组织水肿，导致组织损伤，但有实验证明VEGF使血管通透性增加，促进血浆蛋白外渗的作用要早于缺血再灌注后的组织水肿，故可认为VEGF不直接导致组织水肿。相反，有研究表明VEGF可以通过保护内皮细胞进而保护血脑屏障来减轻脑水肿。

2 .1.3 对神经系统的保护作用 目前研究比较多的是关于VEGF在脑缺血再灌注中的保护作用，许多试验表明 VEGF对神经组织有直接的保护作用。VEGF还可以刺激神经元轴突生长，促进胶质细胞分裂、迁移、存活，另外还有促进神经再生的作用。

综上VEGF是HIF-1的一个重要靶基因，也是血管生成的主要调节因子。脑缺血后，HIF-1使VEGF表达增加,促进了微循环重建，增加缺血组织血流灌注和供氧量，加快脑缺血缺氧的恢复过程【7】。VEGF基因的表达虽受多种因子的调控，但缺氧是其最主要的调节因素。缺氧时HIF-1通过与VEGF基因5’端的缺氧反应元件( hypoxia response element，HRE ) 结合， 提高其转录。缺氧时HIF-1a 仅积聚，并且DNA结合活性增加，HIF-1a 仅与VEGF基因的HRE结合后，促进了VEGF的转录和表达，并增加缺氧情况下VEGF mRNA的稳定性，VEGF进而作用于存在血管内皮细胞表面的血管内皮生长因子受体-1 ( VEGFR-1 )和血管内皮生长因子受体-2 ( VEGFR-2 ) ，从而激活了一系列的缺血转导通路， 诱导新生血管的生成。缺乏 HRE启动子的VEGF基因在低氧时表达并不增高 ，致使新生的血管减少，运动神经元变性增加，说明VEGF的上调是通过HIF-1作用实现的。在缺氧反应的过程中，VEGF mRNA的稳定性起着关键作用。VEGF mRNA的半衰期在正常条件下较短，约为30分钟，但在缺氧条件下可增加到 6～ 8小时，这说明 VEGF在缺氧条件下受HIF-1的调节不仅发生在转录水平,同时也发生在转录后的水平。激活的HIF-1促使VEGF和VEGF受体表达增加，刺激缺氧组织建立有效的侧支循环，并恢复内皮细胞的完整性，发挥自身搭桥作用,诱导新生血管形成,并使新生血管从正常组织向半暗带及缺血中心区延伸,增加受累脑组织再灌注及供氧量，从而减少脑的缺血再灌注损伤。通过基因或药物手段调节HIF-1的活性，可防止脑缺血【8】。

2.2低氧诱导因子（HIF-1）作用于促红细胞生成素而发挥脑保护作用

EPO是一种相对分子质量为3 0×1 0 ～ 3 9×1 0 的糖蛋白， 主要来源于肾小管问质细胞和肝实质细胞。HIF-1作用于EPO3’端的启动子，促进EPO的转录。EPO对缺血再灌注组织的保护作用主要有以下几个方面：

2.2. 1 E P O经典的作用是作用于骨髓巨核前体细胞,刺激红祖细胞及早幼红细胞形成成熟的红细胞集落并释放进入血液，提高血液内红细胞数量及携氧量。

2.2 .2 EPO与细胞凋亡： 目前认为抗凋亡作用可能是EPO对组织器官缺血再灌注保护作用的重要机制，根据目前的研究，其机制为：EPO与其受体EPOR结合，并启动细胞内的信号传导机制， 增加抗凋亡蛋白的表达，发挥抗凋亡作用。另外，EPO还可降低血中有促进凋亡作用的细胞因子。研究表明EPO—EPOR的细胞内信号传导机制具有组织特异性，

在不同的细胞及组织中不尽相同【21.22】。

2.2.3 EPO对血管的保护：EPO对血管的保护作用不仅是保持内皮细胞的完整性，更重要的是EPO还能促进血管新生。EPO在体内、体外都有促血管生成作用，且与VEGF有相似的成血管潜能。EPO能通过促进血管内皮细胞增生、分化、迁移，来介导血管生成,从而对维持和重建血供,促进损伤修复有重要意义。另外,根据研究，EPO在体内促血管生成作用可

能部分与促进骨髓内皮起源细胞( EPC)迁移至成血管处分化为血管有关.。

2.2.4 此外，EPO可以通过上调抗氧化酶的表达及下调氧自由基的生成发挥其抗氧化作用。EPO还可以抑制许多致炎因子的释放，从而减轻炎性细胞的浸润，发挥对缺血再灌注组织的保护作用。另外，在神经组织中E P O还可抑制谷氨酸的释放，减轻谷氨酸与N -甲基-D-天冬氨酸( NMDA)受体结合，介导的钙钠通道开放，大量持续的钙内流可以引起神经元坏死。根据目前的研究，EPO抑制谷氨酸释放的机制可能为抑制谷氨酸的转录与翻译 。低氧条件下激活的HIF-1能诱导脑源性的EPO生成 ，其与血源性EPO比较 ，产生的量少，但具有更高的活性，脑源性EPO对缺血导致神经细胞损伤有重要的保护作用。其机制如下：①抗炎症作用。小胶质细胞激活后可上调多种表面受体，释放大量重要的促炎症因子。EPO通过调节小胶质细胞激活以及控制细胞因子的释放，从而维持细胞内环境的稳定。此外，EPO通过抑制一些促炎因子，如白细胞介素_ 6( I L - 6) 、TNF-a和单核细胞化学趋化因子蛋白-1的产生以及抑制炎症细胞聚集而直接参与细胞炎症反应【9】。在脑和脊髓的创伤和缺血损伤以及多发性硬化模型中，EPO的抗炎作用已得到验证。细胞死亡有炎性坏死和细胞凋亡两种方式。EPO对神经的保护作用在于对这两种方式的阻断， 神经细胞 EPO受体被激活后通过干扰非受体型酪氨酸激酶（ janus- amino tyrosine kinase - 2 ，JAK-2) 和核转录因子-κB ( NF -κB ) ，能防止N-甲基-D -天冬氨酸( NMDA) 和NO诱导的凋亡。EPO在