中央民族大学生命与环境科学学院 微生物综合设计性实验报告

2015年1月4日 化学抑杀菌剂的效果评价 —青霉素链霉素抑菌效果评价 杜盈雪 中央民族大学 北京市海淀区 100081 摘要：目的 本实验以大肠杆菌、白色葡萄球菌为实验材料，选取青霉素、链霉素两种抗生素为化学抑菌

剂，通过观察抑菌圈的大小确定抗生素的有效浓度来判断抗生素的抑菌效果，并进行同一抗生素对不同菌种抑菌效果的比较以及不同抗生素对同一菌种抑菌效果的比较。方法 本实验通过滤纸片法来确定两种抗生素对两种菌种的最小抑制细菌浓度MIC来判断抗生素的抑菌效果。并通过挑取抑菌圈内的菌种于新的培养基继续培养的方法判断抗生素的效果是抑菌还是杀菌。结果 链霉素对白色葡萄球菌的最小抑菌浓度是12μg/ml；链霉素对大肠杆菌的最小抑菌浓度是10μg/ml。青霉素对白色葡萄球菌的最小抑菌浓度为500μg/ml；青霉素对大肠杆菌的最小抑菌浓度为550 μg/ml。链霉素青霉素对大肠杆菌和白色葡萄球菌均为抑菌作用。结论 青霉素和链霉素均为作用强度中等的抗生素，链霉素的抑菌作用强于青霉素。 关键词：大肠杆菌、白色葡萄球菌、抗生素、最小抑制细菌浓度MIC，抑杀菌

Evaluation of bactericide effect of chemical inhibition

—Evaluation of bactericide effect of penicillin and streptomycin Du yingxue Minzu University of China Haidian District, Beijing 100081

Abstract：Objective In this experiment, We make escherichia coli, Staphylococcus aureus as experiment

materials, the selection of penicillin, streptomycin two antibiotics as chemical antimicrobial agent,in order to determine the inhibitory effect of antibiotics by observing the size of bacteriostatic circle determine the effective concentration of the antibiotics, and compared the same antibiotic bacteriostatic effect on different species and different antibiotic bacteriostatic effect on the same strain comparison . Methods This experiment by filter paper method to determine two kinds of antibiotics against two strains bacteria MIC to determine the minimum inhibitory concentration of the inhibitory effect of antibiotics. Method for judging the antibiotic and bacteriostatic ring through the selected within the strains in the new culture medium to culture effect is bacteriostatic or bactericidal. Results The minimum inhibitory concentration of streptomycin on Staphylococcus aureus is 12 μg/ml; minimum inhibitory concentration of streptomycin on Escherichia coli is 10 μg/ml. The minimum inhibitory concentrations of penicillin on white staphylococcus is 500 μg/ml; the minimum inhibitory concentrations of penicillin on Escherichia coli is 550 μg/ml. Penicillin streptomycin were bacteriostatic effect on Escherichia coli and Staphylococcus aureus . Conclusions Penicillin and streptomycin were medium intensity effect of antibiotics, streptomycin. is stronger than penicillin in bacteriostatic action .

Keywords : Escherichia coli , Staphylococcus albus , Antibiotics , MIC , Inhibiting or killing bacteria

前言

【研究背景】 目前，人们在日常生活中经常使用抗生素，对于抗生素的抗菌机制的研究已经以非常深入，对于滤纸片法的操作技术已经比较娴熟。本实验对常用抗生素青霉素、链霉素对大肠杆菌和白泽葡萄球菌的抑菌效果进行评价。 【研究目的】 本实验通过探究两种抗生素对两种菌的MIC，比较青霉素、链霉素对大肠杆菌、白色葡萄球菌的抑菌作用的差异，并且进行不同抗生素对同一菌种抑菌效果的比较以及同一抗生素对不同菌种抑菌效果的比较。通过观察培养基内是否有菌落形成判断青霉素、链霉素对两种菌的作用是杀菌还是抑菌。 【解决方法】 抗生素效价的测定是生产和药检部门都必须做的，测定方法都是严格按照国家药典规定的方法进行。本实验使用的滤纸片法和国家药典中规定的管碟法相类似，先得出一个大致的有效浓度范围，然后继续在有效浓度范围中找出最小抑菌浓度，最后通过挑取抑菌效果最好的抑菌圈内的菌种继续培养，观察继续培养的培养基内是否有菌落产生来判断抗生素是抑菌还是杀菌。

1.材料和方法 1.1 实验材料 菌种：大肠杆菌，白色葡萄球菌。 化学药剂：青霉素（10mg/mL），链霉素（10mg/mL）。

1.2 实验原理 1.2.1 关于抗生素 抗生素是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）产生、能抑制或杀灭其他微生物的物质。抗生素既不参与细胞结构，也不是细胞内的贮存性养料，对产生菌本身无害，但对某些微生物有拮抗作用，是微生物在种间竞争中战胜其他微生物保存自己的一种防卫机制。

1.2.2 杀菌机制 霉素作用于细菌体内核糖体30s亚单位，抑制细菌蛋白质的合成，破坏细菌细胞膜的完整性。对革兰氏阳性菌，阴性菌都有效果； 青霉素抑制细胞壁的合成，一般对革兰氏阳性菌更有效果。 1.2.3 关于滤纸片法 适用条件——不易挥发的化学药剂 工作原理——利用滤纸作为药剂的承载体，放置于含有待检测菌种的平板上，使药剂在琼脂中扩散。待检药剂在不同浓度下对细菌的抑菌效力以产生可见的抑菌圈作为评价标准。以抑菌圈直径为测定指标，抑菌圈直径越大，该药剂的杀菌能力越强。

1.2.4 关于结果的判定 1.以直径为6mm为标准：抑菌圈直径>7mm，有抑制细菌作用；抑菌圈直径<10mm，低度敏感药物；抑菌圈直径为10~15mm，中度敏感药物；抑菌圈直径>15mm，高度敏感药物。 2.有效浓度在100 mg/L （100μg/mL）以上属于作用强度较低的抗生素； 有效浓度在l mg/L （0.1μg/mL）以下是作用强度高的抗生素。

1.3 试剂与仪器 仪器：高压灭菌锅，恒温培养箱，鼓风干燥箱，超净工作台，移液器，微波炉，打孔器等。 试剂及其他：生理盐水，NaOH(1mol/L)，HCl(1mol/L)， 滤纸片（Ф=6mm），酒精灯，平板，4支移液管，（1ml），试管，接种环，涂布棒，镊子，烧杯，三角瓶，玻璃棒等

1.4 培养基 营养琼脂培养基（牛肉膏1.5g,蛋白胨5g，NaCl2.5g,琼脂9g,水500ml,PH7.0~7.2），供菌种生长。

1.5 实验方法 1.5.1 灭菌方法 培养皿灭菌（培养皿筒在鼓风干燥箱中灭菌3小时，温度为160度），移液管、涂布棒包扎好后与培养皿筒同时灭菌，用打孔器100个滤纸片，包好，配置500ml营养琼脂培养基（牛肉膏1.5g,蛋白胨5g，NaCl2.5g,琼脂9g,水500ml,PH7.0~7.2），配制培养基后，分装于6只试管（每管6ml）及三角瓶，包扎，胶头及枪头，7只试管（每管10ml0.9％生理盐水）把上述材料121℃灭菌20min。

1.5.2 药品稀释 采用二倍稀释法：将抗生素稀释为100 μg/mL，50 μg/mL，25 μg/mL，12.5 μg/mL，6.25 μg/mL或采用等距稀释法将抗生素稀释到所需浓度。 1.5.3 扩繁 趁热拉斜面，稍微冷却倒平板，冷却至室温后，在酒精灯附近，在拉好的斜面上用划线法扩繁，在37℃恒温培养箱中培养24h。

1.5.4 菌悬液的制备 将灭菌后的5ml左右的生理盐水分别倒入大肠杆菌，白色葡萄球菌的斜面培养基中，用接种环搅动，使细菌均匀分布生理盐水中。

1.5.5 涂布法接种 涂布接种，振荡菌悬液，用移液管吸取0.2ml的菌悬液于培养基中，用涂布棒涂抹均匀。 1.5.6 滤纸片的制作 在灭菌后的洁净培养皿里，用规格为20μL的移液器分别吸取20μL不同种类不同浓度的药品，分别打在滤纸片上，控干一定时间。按照滤纸片粘贴示意图进行操作。 2. 结果与分析 2.1 两种抗生素第一次实验的结果 2.1.1 两种抗生素在100 、50、25 、12.5、6.25 （μg/mL）下抑菌圈大小的效果图

图1 两种抗生素第一次实验抑菌圈大小（滤纸片粘贴如图2所示） Figure 1 The bacteriostatic ring size of two kinds of antibiotics in the first experiment

图2 滤纸片粘贴示意图 Figure 2 Schematic diagram of filter paper paste （A: 100μg/ml B: 50μg/ml C: 25μg/ml D: 12.5μg/ml E: 6.25μg/ml）