脊髓缺血再灌注损伤中的脊髓血流量与组织病理学变化的相关性 杨小玉 朱庆三 刘光耀 段德生 吉林大学中日联谊医院骨科 长春市 仙台大街2号130031

【摘要】 目的 探讨脊髓缺血再灌流损伤过程中的脊髓血流量与组织病理学变化的关系。方法 脊髓缺血再灌注损伤模型建立，通过阻断大鼠腹主动脉造成脊髓腰尾段缺血。按缺血和再灌流各时间段分别阻断开放腹主动脉。应用激光多谱勒血流仪，分别连续测定腰髓血流变化。取缺血前、缺血30分钟、缺血60分钟，缺血30分钟再灌2、4、6、9、12、24h局部脊髓组织进行组织病理和透射电镜检查。结果：在缺血30分钟时腰髓局部血灌流量迅速下降至基线值的-77.51%(P值=2.01E-17) 。再灌流时，局部血流迅速增高并超过基线水平。再灌流10分钟，局部血灌流量与基线的百分比变化值为60.38%(P值=3.3E-7)，随后逐渐降低，再灌流30分钟后，局部血灌流基本恢复基线水平(3.7% P值=0.437899)，以后血流量低于基线水平，出现缺血后延迟低灌流。直至再灌流4小时(-23.5%,P值=1.34E-3)，低灌流保持相对稳定，血流未见恢复。结论 再灌注期组织损伤较缺血期严重，且病理学改变程度与再灌流有时间相关性，同时表明再灌流后脊髓发生了二次损伤，脊髓微循环障碍在脊髓缺血再灌注损伤中起重要作用,是脊髓再灌注损伤过程中的重要病理学基础。

【关键词】脊髓缺血再灌注损伤 血流 激光多普勒血流测定仪 组织病理学 Correlation of Histopathology Changes and Spinal Cord Blood Flow in Spinal Cord Ischemical Reperfusion Injury .／Yang Xiaoyu ,ZHU Qing san ,LIU Gingchen, ,LI Yingpu，ZHAO Baollin ,YANG Xiaoyu ,LIN Ye,XING Hongjian orthopedics’department of China-Japanese friendship hospital,，Jilin university Changchun City.130031 【Abstract】 Objective: To study the correlation of histopathology changes and spinal cord blood flow after spinal cord ischemical reperfusion injury . Method Model Set-up of ischemic spinal cord injury. Occlusion of the abdominal aorta produces lumbosacral spinal cord ischemia. Abdominal aorta was obstructed and opened according to events of ischemia - referfusion. Laser- Doppler flowmetry was employed to measure hemodynamic changes in the oumbal spinal cord. The lumbo-sacral cord tissue blook was rapidly dissected for the examination of histopathology and transmission electron microscopy according to preichemia, 30 min of ischemia, 60 min of ischemia,and 2, 4, 6, 9h and 12h of reperfusion respectively. Results: The lumbar local SCBF decreased rapidly to – 77.51%(p=2.01E-17), percentage changes of the mean baseline value after 30 min of ischemial. The onset of reperfusion, the SCBF increased rapidly and exceeded the baseline level.The SCBF was 60.38% (p=3.3E-7) of baseline at 10 min of reperfusion. And the local blood perfusion basically recovered baseline level after 30 min of perfusion(3.7% of baseline, p=0.437899). After wards, the SCBF decreased gradually. Up to 4h of reperfusion(-23.5% of baseline, p=1.34E-3) , the SCBF did not return to the baseline level. Conclusion

基金项目：吉林省科学自然基金项目资助 （990563-1） 第一作者简介：女（1959－）教授 医学博士后，研究方向：脊柱外科基础 电话（0431）－5649255 E-mail:yangxiaoyu 88@sina.com Damage of spinal cord tissue in the hypoperfusion phase is serious than its ischemia phase , There are time correlation in the degree of pathology changes and hypoperfusion .At the same time , twice lesion of spinal cord has been occured by spinal cord hypoperfusion. Microcirculation disorder of spinal cord is important base of the pathology. 【Key】 Spinal cord Ischemical reperfusion injury Blood flow Laser- doppler flowmetry Histopathology

脊髓损伤(spinal cord injury SCI)一直是困扰医学界的一大难题。临床研究中常见到SCI 在解剖上并非完全横断,伤情并不严重,减压后症状有所缓解，但以后发展为“二次瘫痪”。临床上对于SCI 治疗常见于针对缺血恢复血供,而忽视了脊髓再灌注损伤。近二年许多研究表明[1-3]，SCI 后动物双后肢出 现二次瘫痪与脊髓组织延迟性低灌流密切相关, 脊髓微循环障碍在脊髓二次损伤中起着重要作用, 因而提出了脊髓存在着缺血再灌注损伤(spinal cord ischemia reperfusion injury I/R),然而,由脊髓再灌注引发的微循环障、病理生理、生化因子参与的脊髓组织进行性、自毁性破坏病理过程仍不十分清楚。因此，本文针对缺血再灌注损伤中脊髓血流量与组织病理学变化进行了动态观察，为临床阻遏脊髓继发性损害提供科学实验依据。

1. 材料和方法 1.1脊髓缺血再灌注损伤模型建立： 实验动物分组:Wistar大鼠,体重180-260g,平均220g, 雌雄不限,随机分为正常组、单纯缺血组和缺血再灌组。正常组：(仅麻醉动物不进行阻断血流量)，单纯缺血组:阻断血流30、60min。单纯缺血再灌组：根据所需时间点设计缺血30min后再灌注60min、2、4、6、12、24h组,每组5只鼠，总计40只鼠。 1.2 手术方法: 用戊巴比妥纳35mg,kg-1ip麻醉后将鼠称重采用Zivin[4]法复制模型，鼠俯卧位置于特制台上, 背部剪毛，无菌操作下，腰椎取背部正中切口，切除L2-L 4双侧椎板,充分显露L3-L4节段硬脊膜。然后仰卧位于台上，腹部剪毛，取腹正中切口。手术分离腹主动脉至肾动脉水平，在左肾动脉起始部远端用Scoville-Lewis动脉夹夹闭腹主动脉，根据所需测定时间点进行阻断血流，暂时关闭腹腔至动物苏醒。然后再次麻醉动物，打开刀口后松夹恢复血流，重新关腹。制成脊髓缺血－再灌注损伤模型，可调式加热垫置于动物身下，室温保持22℃,通风良好。 1.3脊髓I/R损伤血流动力学监测 选用Peri Flux PF3激光多普勒血灌流监测仪(Laser Doppler Perfusion Monitor),由瑞典Perimed AB公司生产(Perimed AB,Stockholm, Sweden)。技术参数为：激光二极管光源，2mW氦－氖激光(He-Ne Laser),波长为 632.8um。光行探头:PF303不锈钢探头( Stainless Steel Probe ,直径为1.0mm,纤维分离(Fibre Separation) 0.25mm。一台瑞典ALR公司(Advanced Logic Research, Inc)生产的386台式微机(Power Flex 20sx) 与激光多普勒Peri Flux PF3相连,通过专门的软件程序PERISOFT进行操作,显示并记录波形,计算并存储血流数据。将光纤探头PR303用微型支架固定于L1-2脊髓节段背侧硬脊膜表面上,触而不压,既适于动物呼吸又保持测定区域恒定。术野和探头覆盖1%琼脂液(溶于0.9%生理盐水)。被测区域为避开可视血管，距后中央沟1-2mm局部区域。血流仪增益(Gain)为1,最大上限频率 ( Upper Frequency Limit)12Kz,即宽频(Wide band)状态。开机预热30 分钟后，先测定腰髓局部基线血流,连续记录10-20分钟。然后按缺血和再灌流各时间段分别连续测定血流变化，显示血流变化的LDF输出信号被记录并存储在微机内的专门软件PERISOFT程序中,确定时间区段(Event),计算平均值。 1.4病理形态学观察 将实验组缺血前、缺血30、60min 、缺血30min再灌4、6、12、24h,分别在活体状态下取同一节段脊髓行病理学检查。 1.4.1石蜡切片光镜观察 实验组大鼠用小剪刀将脊椎管扩大,切除周围神经根, 将同一节段脊髓取出，用4%多聚甲醛固定24h 后常规石蜡切片,HE染色,光镜观察。 1.4.2尼氏染色:缓冲亚甲兰法 新鲜组织固定于10%甲醛液，按常规脱水、浸蜡、包埋，石蜡切片5μm，切片脱蜡至水,蒸馏水洗,入缓冲液亚甲兰染色内染10分钟,0.2N 醋酸盐缓冲液(PH4.6)分化1-3分钟,并在显微镜下观察,至尼氏体清晰为止。4%钼酸铵液处理3-5分钟,蒸馏水洗, 常规脱水透明,中性树胶封片,尼氏体染成鲜兰色。随机选取缺血前、缺血30分钟、再灌流4 小时各组脊髓前角有核细胞各30个,应用 Luzes- F 型图像分析系统(Japan),在20倍物镜下测定尼氏体平均灰度和平均面积。 1.4.3电镜标本制备及观察 按40kg·kg-1用3%戊巴比妥钠经腹腔注射麻醉后,剪开腹腔,暴露心脏,经左心室穿刺,先用37℃,0.9%生理盐水心脏灌洗,再用2.5%戊二醛进行灌洗固定。取腰髓在解剖显微镜下定位于脊髓前角,经1%锇酸后固定,逐级乙醇, 丙酮系列脱水,Epon812包埋,半薄切片定位,LKB 超薄切片机切片,片厚700A。经醋酸双氧铀-柠酸铅双重染色, 在日产JEM-1200EX透射电镜下观察并摄片。