硝化细菌
反硝化细菌 硝酸细菌（又称硝化细菌） 亚硝酸细菌（又称氨氧化菌）
作用
亚硝酸在硝化菌的硝化作用下转变成硝酸后，很容易形成硝酸盐 氨在亚硝化菌作用下转化成亚硝酸。（亚硝酸与一些金属离子结合以后可以形成亚硝酸盐，而亚硝酸盐又可以和胺类物质结合，形成具有强烈致癌作用的亚硝胺。） 将硝态氮或亚硝态氮还原成含氮气体或氮气
关键功能基因 编码亚硝酸盐还原酶的基因
生长
温度 大多数硝化细菌的适宜生长温度为l0—38℃，高于20℃时其活性较高，但超过38℃时硝化作用会消失。当环境温度低于20℃时，氨的转化会受到影响。 大多数硝化细菌的适宜生长温度为l0—38℃，高于20℃时其活性较高，但超过38℃时硝化作用会消失。当环境温度低于20℃时，氨的转化会受到影响。
PH 6．0—8．5 6．0—8．0
氮源 亚硝酸钾（钠） 硫酸铵
营养
类型 化能自养型 化能自养型 化能异养型
与氧气的关系 好氧性细菌 好氧性细菌 兼性厌氧菌
硝化细菌 备注 硝化细菌 亚硝化细菌
富集
培养 取1ml污水水样加入至10ml富集培养基中，28°C振荡培养5d。再取1ml富集培养物加入至新鲜的富集培养基中，如此富集3次。 取1ml污水水样加入至10ml富集培养基中，28°C振荡培养5d。再取1ml富集培养物加入至新鲜的富集培养基中，如此富集5次。 定期观察培养基的透明度，变浑浊后立即进行再次富集。（后期培养过程中可以连续加入5%的亚硝酸钾或硫酸铵数毫升，增加目的菌数，并抑制其他菌的数目）
具体步骤：一次富集取5ml水样至50ml富集培养基中（此过程于150ml锥形瓶中进行）同时做3个平行【共6个150ml锥形瓶】； 二次富集再取1ml一次富集物至50ml富集培养基中（此过程于150ml锥形瓶中进行）【共6个50ml锥形瓶】； 三次富集取1ml一次富集物加入至10ml富集培养基中于50ml锥形瓶中进行【共6个50ml锥形瓶】 (大约需20天完成)【定期涂板检验富集程度，固体富集培养基】
菌种分离纯化 取100微升富集培养液，加入900微升无菌水，依次得到10 1、10
2、10 3、10 4···10
8梯度的菌悬液，另取0.1 mL菌悬液在硝化细菌平板分离固体培养基上涂布，28℃恒温箱中培养10 d，得到单菌落，转接斜面或平板。 取100微升富集培养液，加入900微升无菌水，依次得到10 1、10 2、10 3、10 4···10 8梯度的菌悬液，分别取0.1 mL菌悬液于在亚硝化细菌平板分离固体培养基上涂布，28℃恒温箱中培养10 d，得到单菌落，转接斜面或平板。 目的是得到纯菌株，培养基上的单菌落。（做好拍照，做好实验记录）
具体步骤：一次分离：为节省平板可采用划线分离的方法，用接种环蘸取适量三次富集培养基在平板上划线，各做两个平行，培养一定时间后进行二次分离【需12个平板】； 二次分离：用接种环蘸取单菌落在装有适量无菌水的离心管里稀释，再次划线分离，在分离培养基上进行，为节省平板可以将平板划分为不同区域，每个平板可以分离3个单菌落。 三次分离：挑取形态不同的单菌落在装有1ml富集培养基的离心管中，摇菌，每种挑取三个平行，涂板时根据浓度进行稀释，不同梯度进行； 四、鉴定纯种。挑取单菌落摇菌，做菌液PCR，电泳检测结果，酶切鉴定，用两种酶分别进行单酶切，若每个平板上的酶切结果相同，则初步确定为同一种菌，并去除同一种菌，进行菌种保藏，1ml加300微升甘油于-20℃保存。
选择优势菌 种
硝化细菌相关培养基：
1、富集培养基：
硝化细菌富集培养基： KNO2 0.5g; KH2PO4 0.07g;
MgSO4 7H2O 0.055g; CaCl2 2H2O 0.05g;
蒸馏水100ml; 用5%Na2CO3调pH至8.0.
亚硝化细菌富集培养基： (NH4)2SO4 0.5g; KH2PO4 0.07g;
MgSO4 7H2O 0.055g; CaCl2 2H2O 0.05g;
蒸馏水100ml; 用5%Na2CO3调pH至8.0.
2、分离固体培养基：
硝化细菌平板分离固体培养基： KNO2 0.05 g； K2HPO4 3H2O 0.13 g；
MgSO4 7H2O 0.03 g； NaCl 0.12 g；
FeSO4 7H2O 0.02 g； CaCO3 (MgCO3) 0.1 g；
NaHCO3 0.2 g； H2O 100 mL；
琼脂：1.5—2.0g pH 7.5 ~ 8.0．
亚硝化细菌平板分离固体培养基：(NH4) 2SO4 0.05 g； K2HPO4 3H2O 0.13 g；
MgSO4 7H2O 0.03 g； NaCl 0.12 g；
FeSO4 7H2O 0.02 g； CaCO3 (MgCO3) 0.1 g；
NaHCO3 0.2 g； H2O 100 mL；
琼脂：1.5—2.0g pH 7.5 ~ 8.0．
3 杂菌检验培养基：
（1）检查异养型细菌：
牛肉膏蛋白胨培养基（100ml）： 酵母粉：0.5g 胰蛋白胨：1.0g
氯化钠：1.0g 琼脂：1g
(2) 检查酵母菌：
豆芽汁葡萄糖培养基： 10%豆芽浸汁100ml 葡萄糖5g 琼脂1.5—2.0g
自然PH
(3) 检查霉菌:
马铃薯葡萄糖培养基: 20%马铃薯浸汁100ml 葡萄糖2g 琼脂1.5—2.0g
自然PH
反硝化细菌 备注
富集培养 取污水1ml, 接种于无菌反硝化细菌富集培养液中, 置于28 ℃ 培养箱中静置培养. 培养4~ 5 d 后,
以20%的接种量接入新鲜的富集培养液中, 如此反复3~ 4 次, 直到获得优势种. 培养液变浑浊并产生气泡,说明有反硝化细菌生长.
菌种分离纯化 采用划线分离法，用牙签将菌悬液在反硝化细菌分离培养基上划线，28℃下培养，挑取单菌落，转接至另一平板上。可多次循环。 及时观察，注意拍照记录。
确定单菌落
1、富集培养基：
反硝化细菌富集培养基: KNO3 2 g, 柠檬酸钠5 g, K2HPO4 1 g, MgSO4·7H2O
0.2g, 微量元素 蒸馏水1 000mL, 121 ℃ , 灭菌20
min.
2、反硝化细菌分离培养基： KNO3 2 g, 柠檬酸钠5 g, K2HPO4 1 g, 微量元素
MgSO4·7H2O 0.2g, 蒸馏水1 000mL, 琼脂
121 ℃ , 灭菌20 min.
反硝化细菌为异养型菌，故可以在LB培养基上培养。