第17卷 第3期 2007年3月阿维菌素的生物合成研究进展与展望*陈 芝 宋 渊 文 莹 李季伦**中国农业大学生物学院微生物系,北京100094

2006207219收稿,2006208218收修改稿 *国家重点基础研究发展计划资助项目(批准号:2003CB114205) **通信作者,E2mail:lijilun@cau.edu.cn

摘要 阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)由于可以产生杀虫抗生素)))阿维菌素而备受研究者的青睐.多年来该菌得到了全面系统的研究,其基因组序列也已测定.文中综述了阿维链霉菌中阿维菌素生物合成代谢途径方面的研究,并对后续研究进行展望.

关键词 阿维链霉菌 阿维菌素 次级代谢 生物合成 基因工程 组合生物合成

1 阿维链霉菌及其基因组信息阿维菌素的产生菌)))阿维链霉菌(Strepto2mycesavermitilis)是1975年日本北里研究所从日本静岗县的一个土壤样品中分离得到的.阿维链霉菌自发现以来,以日本北里大学和北里研究所以及美国Merk公司为主的研究小组分别对它开展了深入研究,形成了一个重要的抗生素研究领域.与其他链霉菌一样,阿维链霉菌不仅具有复杂的形态分化,也具有合成多种次级代谢产物的能力,由它产生的阿维菌素在医药、农业及畜牧业上有着重要的商业价值.目前对阿维链霉菌的研究主要集中在阿维菌素的生物合成领域[1)5].链霉菌中天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicol2or)A3(2)[6]、阿维链霉菌MA24680[7]和Strepto2mycesdiversa的基因组序列已被测定,此外还有一些链霉菌(S.noursei,S.ambofaciens,S.peucetius和S.scabies)的基因组正在测定中(http://www.genomesonline.org/search.cgi).对它们的基因组序列的比较将为这些微生物的研究提供有价值的信息.阿维链霉菌的线状染色体大小为9025608bp,G+C含量为70.7%,至少包含7577个开放阅读框(ORF),编码区占基因组的86.2%.ORF平均大小为1034bp.阿维链霉菌还含有一个线性质粒SAP1,大小为94287bp,G+C含量为69.2%,含有96个ORF,编码区占质粒的79.0%.在阿维链霉菌的基因组中,大多数必需基因都位于一个高度保守的6.5Mb的内部区域.染色体上靠近端粒的位置有两个保守性低的亚端粒区(subtelomericre2gions).有趣的是,50%以上的与次级代谢合成有关的基因(包括阿维菌素的生物合成基因)都位于亚端粒区,而在亚端粒区没有发现已知的必需基因.此外,亚端粒区含有基因组中大部分的转座因子[7].这些基因位于亚端粒区可能与阿维链霉菌的

遗传不稳定性有关,在对阿维链霉菌培养过程中我们经常得到一些形态分化的突变株(光秃型突变株和白色突变株等),有些突变株同时丧失了合成阿维菌素的能力.在阿维链霉菌的线状染色体上有30个基因簇与次级代谢合成有关,共有271个基因,占基因组的6.6%.它们广泛地分布于染色体上,但有一半位于染色体的末端.在质粒SAP1上没有发现与次级代谢有关的基因簇[7,8].在30个与次级代谢有关

的基因簇中,有4个与黑色素的合成有关,其中两个负责酪氨酸酶及其辅酶的合成,另外两个分别与由尿黑酸生成的赭色色素和聚酮结构的黑色素的合成有关;合成类胡萝卜素和铁载体的基因簇分别由7个和5个基因组成;此外,有8个基因簇与非核

290糖体肽类化合物的合成有关,还有4个基因簇与萜类化合物的合成有关.在30个次级代谢的基因簇中,有9个基因簇含有Ñ型PKS基因(polyketidesynthase),2个基因簇含有Ò型PKS基因.目前已有3个Ñ型PKS合成的化合物被鉴定,它们分别是阿维菌素、寡霉素以及菲律宾菌素(filipin)的衍生物)pentaene[8].阿维链霉菌和其他链霉菌的基因组计划必将极大地推动对链霉菌形态分化和次级代谢的研究,最终揭示链霉菌复杂的调控网络.2 阿维菌素的生物合成基因簇阿维菌素是由阿维链霉菌产生的一组结构相似的十六元环大环内酯类抗生素.阿维菌素的天然发酵产物共有8个组分:A1a,A1b,A2a,A2b,B1a,B1b,B2a和B2b,它们的区别主要在于C25,C222,23和C226位所连接的基团不同(图1).Cane等通过在阿维菌素合成过程中掺入相应的13C标记的化

合物,表明阿维菌素的大环内酯是由7个乙酸盐,5个丙酸盐和1个带有支链的脂肪酸首尾聚合而成[9]./a0组分的22甲基丁酰基(C252C28)和/b0

组分的异丁酰基(C252C27)分别由L2异亮氨酸和L2缬氨酸衍生而成[10].齐墩果糖由葡萄糖直接转化而来[11].阿维菌素中C25,C23c和C23d位上的甲氧

基均来自L2甲硫氨酸.

图1 阿维菌素及伊维菌素结构图 Ikeda等利用标记底物结合分析突变株累积中间产物的策略,已基本阐明阿维菌素生物合成的全过程[1],并对阿维菌素合成的全基因簇序列进行了功能分析[2].该基因簇全长82kb,共有18个开放阅读框(图2).基因簇内部的60kb片段含有4个大的阅读框(aveA12aveA2)和(aveA32aveA4),共同编码多功能的PKS,该聚酮合酶由12个模块组成,共有55个活性位点,负责1个支链脂肪酸、7个乙酸盐和5个丙酸盐的聚合反应.每个合酶单位(SU)都由缩合酶(KS)2酰基转移酶(AT)2酰基载体蛋白(ACP)组成,有些SU还含有酮基还原酶(KR)和脱水酶(DH)活性位点.每个SU负责一步掺入前体如乙酸或丙酸的聚合反应及B2酮基的还原程度,最后所形成的聚酮体在位于PKS末端的硫酯酶(TE)的作用下成环内酯化.aveC和aveE基因位于aveA12aveA2和aveA32aveA4基因之间,与聚酮体的修饰

291 第17卷 第3期 2007年3月有关[12];在基因簇的右侧邻近aveA4基因的上游,是一套涉及合成和转移齐墩果二糖的8个基因(aveBI)aveBVIII);紧邻aveA1的上游(左方)是编码C52O2甲基转移酶的aveD基因,该基因负责将甲基转给阿维菌素B的C25位的2OH从而形成阿维菌素A.aveF紧邻aveD的下游,两者转录方向一致,可能属于同一转录单位[1].aveF编码C52酮基还原酶,催化C25位的酮基还原成羟基.aveR位于aveF的下游(但转录方向相反),它可能是阿维菌素生物合成全基因簇的正调控基因[2].aveR突变株不

能合成任何阿维菌素,也不能转化阿维菌素糖苷配基,对该基因序列分析表明具有H2T2H结构,但是aveR如何调控阿维菌素生物合成有待于进一步研究.

图2 阿维菌素生物合成基因簇[2]3 阿维链霉菌的基因工程改造阿维菌素的生物合成途径已基本阐明,相关合成基因已被克隆和测序,阿维链霉菌的基因组序列也已清楚.这为利用基因工程手段改造阿维菌素生物合成基因簇从而对发酵产物进行有效的控制,以及合成新的阿维菌素衍生物及提高阿维菌素的产量提供了可能.目前对阿维链霉菌中代谢途径的改造主要集中在以下几个方面.

3.1 菌株高产性能的提高阿维菌素是重要的杀虫抗生素,提高阿维菌素的产量具有重要的意义.在链霉菌中,次级代谢产物的生物合成是一个复杂的过程,受到不同水平的调控[13].抗生素的生物合成除受途径专一调节基因

(pathway2specificregulatorygene)控制之外[14],还受多效调控基因(pleiotropicregulatorygenes)的控制,如abaA,abaB,afsQ1和afsQ2等[15],其次

还受到其他调控因子,如ppGpp,A因子和磷酸盐等的调控[16)18].

Lee等利用Southern杂交在阿维链霉菌中检测到了与S.lividans中afsR2基因的同源基因,将多

拷贝的afsR2基因分别转入阿维链霉菌野生型菌株和高产菌株中,阿维菌素的生物合成分别提高了2.3倍和1.5倍[19].Hwang等曾直接将一段包含编码膜蛋白orfX的克隆片段(8.10kb)转入野生型阿维链霉菌,刺激了阿维菌素的生物合成,可使阿维菌素的合成提高近3.5倍[20].对位于aveR基因上

游的aveR1,aveR2基因进行全部或部分缺失,可使阿维菌素的产量提高3倍多[21].王晓芳等[22]对阿维链霉菌野生型菌株和高产菌株中aveR1,aveR2基因分别进行基因缺失,野生型菌株阿维菌素的合成提高了3倍多,但高产菌株产量基本没有提高,可能是高产菌株经历了多次的诱变,其调节基因可能发生了改变.这些结果表明虽然常规诱变育种是菌种选育的有效手段,但是利用基因工程手段也有可能进一步提高菌株的生产能力.Xiong等利用PCR介导的基因中断技术对bkdF基因进行阻断,获得的突变株不再合成阿维菌素,只产生寡霉素,而且寡霉素的产量由原来的0.1mg/mL提高到2.3mg/mL[23].这可能是由于阿维菌素和寡霉素都具有聚酮体结构,拥有共同的底物,阿维菌素合成被阻断导致了代谢流流向了寡霉素的合成.

292 第17卷 第3期 2007年3月3.2 菌株发酵性能的提高阿维菌素的发酵是一个好氧的生物过程,一般对氧的需求比较敏感.由于氧在水中的低溶解性,在大规模深层发酵中,溶氧常成限制因素.文莹等通过将透明颤菌血红蛋白(VHb)基因置于硫链丝菌素诱导的启动子PtipA之下,转入阿维链霉菌,经摇瓶实验证实,表达的VHb蛋白在氧限条件下会明显促进阿维链霉菌的生长和阿维菌素的合成,而且在发酵液中溶氧状况越差,VHb蛋白的效果越显著[24].3.3 无效组分及有毒产物合成的阻断Ikeda小组阐明了阿维菌素的生物合成途径,在明确阿维菌素生物合成途径的基础上,结合传统诱变构建了一系列仅产有效组分的基因工程菌株.经传统诱变获得了仅产4个/B0组分的突变株K2034(aveD)和仅产4个/a0组分的突变株K2021(X)[10],前者是aveD基因(负责编码将B组分转化为A组分的C52O2甲基转移酶)发生了突变,使得菌株只能累积B组分[25];后者是X基因发生了突变.目前X基因尚未得到克隆,但不位于阿维菌素生物合成基因簇中,此基因的突变导致突变株只能合成仅产/a0组分的阿维菌素,推测这个基因可能为支链氨基酸脱氢酶.对这两株突变株进行原生质体融合,得到了仅产B1a和B2a两个组分的重组菌株K2038(aveDX)[10].再对重组菌株K2038内的aveC基因进行点突变,得到仅产单一组分B2a的基因工程菌K2099(aveDXaveC)[1].阿维链霉菌不仅产生阿维菌素,还产生寡霉素.寡霉素是哺乳动物氧化磷酸化的抑制剂,对哺乳动物有很高的毒性.Ikeda等用Tn4560对阿维链霉菌进行转座诱变得到不产寡霉素的突变株,利用转座子上的遗传标记将寡霉素的生物合成基因克隆到温敏质粒上,对上述所构建的有效组分的基因工程菌进行基因取代,得到不产寡霉素仅产阿维菌素有效组分的基因工程菌[1].我们实验室自20世纪90年代以来开展了对阿维菌素合成的研究,初期主要利用常规诱变手段提高阿维菌素产量,近年来也开展了对阿维链霉菌的基因工程改造.通过对aveD基因的插入失活,阻断了C52O2甲基转移酶的合成,与aveD共转录的aveF的表达也被阻断,因此获得了直接合成C52O2阿维菌素B的基因工程菌[26].C52O2阿维菌素B可