小鼠腹水型肝癌细胞系Hca-P/L6的克隆细胞株X淋巴道转 移能力的测定实验

大连医科大学 基础医学院 2011级临床8班

段梦莹A110100259 叶永英A110100255 于舒晗A110100250 刘晋宏A110100256 小鼠腹水型肝癌细胞系Hca-P/L6的克隆细胞株X淋巴道转移能力的测定实验

段梦莹¹，于舒晗¹，叶永英¹，刘晋宏¹，张宏颖²³ （1大连医科大学 基础医学院2011级8班 辽宁 大连 1164002.中国科学院大连化学物理研究所国家色谱研究分析中心,辽宁大连116023; 3. 大连医科大学病理学与法医学教研室,辽宁大连116044） 摘要: [目的]建立小鼠腹水型肝癌淋巴道高转移细胞系HCa - P /L6细胞模型并将其单细胞克隆株接种于615小鼠脚垫培养检测其淋巴道转移能力。[方法]将小鼠腹水型肝癌淋巴道低转移细胞株(HCa - P)经615小鼠腹中线皮下接种的方法获得淋巴结转移瘤1代细胞HCa - P /L1 ,再经小鼠淋巴系统筛选5次,筛选高转移细胞系HCa - P /L6。615小鼠脚垫接种,检测单克隆细胞株淋巴道转移能力。[结果]从HCa - P中筛选出具有多部位转移特性的淋巴道高转移细胞系HCa -P /L6 ,转移率为100%。[结论] 从HCa - P中筛选出了淋巴道高转移细胞系HCa - P /L6。 关键词: HCa - P；HCa - P /L6细胞模型；淋巴道；转移 中图分类号: R286. 91 文献标志码:A

恶性肿瘤的转移是癌症患者死亡的重要原因。为了探索肿瘤转移的某些律，实验中从同一个肿瘤中分离出不同转移能力的克隆细胞, 这对临床肿瘤治疗工作具有非常重要的意义。Hca- F 是小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移单克隆瘤株, 可用于肿瘤淋巴道转移机制的研究及抗肿瘤药物的筛选。1990年大连医学院病理学教研室从小鼠腹水型肝癌淋巴道转移细胞系Hca - F25 /L 中分离出具有淋巴道不同转移能力的两株瘤细胞,其中高转移克隆株HCa - F (16A_3 - F_3)淋巴结转移率为78. 6% ～89. 4% ,低转移克隆株HCa - P (A_2 - 0)淋巴结转移率为15% ～15. 4%[¹] ,被广泛应用于肿瘤淋巴道转移机制研究及药物筛选[2]。根 据瘤异质性( Tumor heterogeneity)学说,恶性肿瘤的不同亚克隆细胞株在生长速度、侵袭能力、对生长信号的反应、对抗癌药物敏感性等方面都可存在差异。1992 年,Chen等[3] 对小鼠腹水型肝癌高(16A_3 - F_3) 、低(A_2 - 0)转移克隆稳定性进行了研究,结果提示,高转移克隆细胞株有效维持时间是在体外传20代以内。2003年,白洁等[4] 对小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移株HCa - F进行再克隆,结果分离出3个转移力不同的瘤株。因此,为了给肿瘤淋巴道转移机制和中药活性成分筛选的研究提供一对可互为对照的转移力不同的肿瘤细胞,必须对低转移细胞株进行重新筛选。本文以小鼠腹水型肝癌淋巴道低转移细胞株HCa - P为瘤源, i采取经体内淋[3]巴系统筛选的方法,筛选具有高转移倾向的小鼠腹水型肝癌细胞系。但近来研究中发现此瘤株的淋巴结转移率不够稳定, 考虑到肿瘤的遗传不稳定性,因此我们选择稳定性较强的小鼠腹水型肝癌淋巴Hca-P/L6-X细胞进行试验。通过可转移性小鼠腹水型肝癌淋巴Hca-P/L6-X细胞转移试验，研究其转移变化规律，从感性上认识肿瘤侵袭与淋巴道转移的生物学特征，了解肿瘤动物实验模型建立的过程及意义并试图建立适用于研究肿瘤淋巴道转移实验模型，我们进行了本次实验。 一、材料 1.1研究对象

1. 1.1 细胞系: 小鼠腹水型肝癌细胞系Hca-P/L6的克隆细胞株X由大连医科大学病理学与法医学教研室张宏颖筛选。 1.1.2 实验动物: 615种系小鼠 ,雄性 , 6～8周龄，体重 18～22 g，由大连医科大学实验动物中心提供 (实验动物生产许可证 SCXK (辽 ) 2002 - 0002,实验动物使用许可证 SYXK(辽 ) 2002 - 0005)。 1.2主要仪器及器皿：搪瓷盆、温度计、离心管、1ml注射器、手术刀、眼科手术剪、眼科手术镊、乳胶手套、生理盐水、1%来苏儿溶液、75%酒精棉、10% 甲醛固定液等。 二、研究方法 2.1细胞系获取。从液氮罐中取出高转移力小鼠腹水型肝癌细胞塑料冻存管，立即放入40度的温水中，一分钟内使冻存液全部融化，立即送入无菌室中。取出细胞悬液放入离心管中，用生理盐水洗涤2次，离心，弃上清，在加1ml生理盐水吹打均匀。向小鼠腹腔内接种0.2mlHCa-F细胞悬液，于第6天无菌条件取腹水。 2.2.615小鼠皮下接种肿瘤细胞。取615小鼠癌性腹水0.1ml（2×10^6个），接种于615小鼠右腋中线皮下。定期观察肿瘤生长及淋巴结肿大情况。于接种18天后处死全部小鼠，取瘤体及相关淋巴结，同时观察肺、肝、肾等器官。将上述组织固定于10%甲醛固定液中，石蜡包埋制片，HE染色，显微镜检查。 2.3.组织取材。将皮下瘤体、淋巴结、肺、肝、肾选取病变部位，切成厚2—3mm的小于2cm×1cm大小的组织块，10%中性甲醛固定。经冲洗（用递升浓度的酒精等）、透明（用二甲苯等）、浸蜡（用石蜡），然后用石蜡将组织包埋成蜡块，再经切片机切片和染色制成切片。作苏木精-伊红染色。 2.4.切片脱色。石蜡切片法、HE染色法。 2.4.1脱水程序及时间：组织固定，冲洗，然后： ①脱水。以下列顺序进行：60%酒精30分钟→80%酒精1—2小时→95%酒精2—4小时或过夜→95%酒精2—4小时→100%酒精2—4小时→100%酒精2—4小时或过夜。 ②透明：二甲苯I30—45分钟；二甲苯Ⅱ30—45分钟。 ③浸蜡。蜡碗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（各30—45分钟）；包埋。 ④修蜡块。修蜡块，贴号。 ⑤切片。 ⑥烘烤。烘烤切片60—70摄氏度，1小时。 ⑦染色。 2.4.2 HE切片染色程序与方法: ①切片脱蜡水洗：将烘干的切片浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5-10分钟： 无水酒精3-10分钟（消除二甲苯）→95%酒精1-3分钟→80%酒精1-3分钟→70%酒精1-3分钟→50%酒精1-3分钟→自来水冲洗5分钟以上（洗去切片上的酒精，切片透明）→蒸馏水清洗（防止污染苏木精染液）。 ②HE染色：苏木精-伊红染色是先用苏木精将组织切片适当的过染，经水洗后再用盐酸酒精分化，弱碱性水溶液显蓝。使胞核呈明显的蓝色，胞质及背景无色。再经水洗后用伊红染胞质，染成深浅不同程度的粉红色至红色：苏木染色（染核）5-15分钟→自来水冲洗3-5分钟→0.5%盐酸酒精溶液分化数秒钟→自来水洗1-5分钟→弱碱性水溶液显蓝30-60秒→自来水冲洗5-10分钟→蒸馏水洗1-2次→伊红1分钟→蒸馏水洗1-2次。 ③脱水、透明、封固：脱水、透明的目的是使存留在切片上的水分及漂浮的染色液全部除净，经透明剂的作用后，将脱水剂清除出来，使切片产生适宜的折光率。最后用盖玻片及封固剂封固，便于观察和长期保存。 80%酒精30-40秒→95%酒精30-60秒→无水酒精Ⅰ1-5分钟→污水酒精Ⅱ1-5分钟→二甲苯Ⅰ1-5分钟→二甲苯Ⅱ1-5分钟→中性树胶封固。 三、实验结果 3.1 HCa - P /L6 -X的形态学特点 将HCa - P细胞接种于小鼠腹部中线皮下, 21 d后小鼠右侧腹股沟淋巴结肿大，腹中线接种部位形成局部移植瘤,质硬,灰白色见图1。右侧腹股沟肿大淋巴结组织(HCa - P /L6 )病理学改变见图2,可见淋巴结中淋巴结部分结构尚存,大的多边形细胞呈片状分布,异型性明显,与原位移植瘤形态相似,表明此淋巴结中的肿瘤组织是移植瘤发生了淋巴道转移的结果。 把HCa - P /L6瘤细胞接种于培养液中培养,在倒置显微镜下的形态见图3,可见细胞呈悬浮生长,体积大,圆形,胞浆透亮,有的成簇生长,部分细胞处于分裂增殖状态,但细胞体积 比HCa - P略大。 图1 HCa - P /L6的单克隆细胞株X接种于615小鼠形成的腹股沟淋巴结转移瘤图片 右侧腹股沟淋巴结肿大,腹中线接种部位形成局部移植瘤,质硬,灰白色。

图2 HCa - P /L6的单克隆细胞株X接种于615小鼠形成的腹股沟淋巴结转移瘤组织学图片 可见大的多边形细胞呈片状分布,大小不等,具有明显的异型性,并可见多核瘤巨细胞。部分细胞呈片状坏死改变,血管间质少。 图3 HCa - P /L6的单克隆细胞株X的形态学特点 细胞呈悬浮生长,体积大,圆形,胞浆透亮,有的成簇生长,部分细胞处于分裂增殖状态,但细胞体积比HCa - P略大

3.2 HCa - P /L6的单克隆细胞株X在 615小鼠淋巴系统内的转移率（表1） 表 1 HCa - P /L6的单克隆细胞株X在 615小鼠淋巴系统内的转移

细胞系 接种数 转移数 淋巴结转移率（％） 腘窝（A） 腹股沟（B） 腋窝（C） HCa - P /L6 20 20 20（100） 20（100） 19（95）

同时转移到A和B20只，A和C19只，B和C19只，A、B和C19只。

四、讨论 4.1由表1证实可移植性小鼠腹水淋巴道向其他部位发生转移。 4.2肿瘤转移，是导致肿瘤复发，促进患者死亡的重要原因。因此研究研究转移的激励和影响因素，对提高恶性肿瘤的治愈率和生.率有很大意义。淋巴道转移是绝大多数癌早期最常见的转移途径，其转移机制尚不清楚[5] 。原因之一是缺乏较好的淋巴道转移动物模型。因此，建立稳定而可靠的淋巴道转移动物模型机有重要的意义。由于肿瘤存在着遗传不稳定性，经过一段时间的使用后，肿瘤的基因有可能发生变异导致其生物学表型的变化。本实验使用的实验动物是近交系615小鼠，雌雄兼用，6~8周龄，体重18-22g，由大连医科大学实验动物中心提供。 4.3高转移力小鼠腹水型肝癌细胞(HCa-P)，是小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移单克隆瘤株，可用于肿瘤淋巴道转移机制的研究及抗肿瘤药物的筛选，由大连医科大学病理教研室建株并保存。 4.4本实验选用615小鼠建立动物实验模型是由于淋巴系统比较发达，易于肝癌淋巴道转移实验的进行，提高试验成功率[4]。小鼠移植性肝癌的一般生物学特性与分化较好的人类肝细胞治疗有很大相似之处，有利于进一步的研究。 4.5恶性肿瘤侵入淋巴管以后随淋巴瘤转移，首先到达局部淋巴结使其发生转移，然后可继续至其他淋巴结，再然后可经胸导管入血继发血道转移。少数肿瘤细胞液可逆性转移或者越过相应的引流淋巴结发生跳跃式转移。 4.6淋巴道转移是恶性上皮肿瘤早期转移的主要形式，若能了解肿瘤淋巴道转移的机制，对于治疗恶性肿瘤有重大意义。但由于肿瘤转移本身的多变性、复杂性，