第4卷第4期农药学学报Vol.4 No.42002年12月CHINESEJOURNALOFPESTICIDESCIENCEDecember2002
除草剂生物筛选研究进展
王树凤1*, 徐礼根2, 马建义3, 陈 杰4
(1.中国亚热带林研究所生物技术室,浙江富阳311400;2.浙江大学生命科学学院,浙江杭州310012;3.浙江省林学院资源与环境系,浙江临安311300;4.国家南方农药创制中心浙江基地,浙江杭州310023)
摘要:生物筛选是除草剂研制开发的重要组成部分。综述了近年来除草剂生物筛选技术的发展概况,重点介绍了除草剂筛选新方法——高通量筛选技术,并指出我国在除草剂筛选方面存在的不足以及解决方案。关键词:除草剂;生物筛选;高通量筛选;组合化学中图分类号:S482.4 文献标识码:A 文章编号:1008-7303(2002)04-0003-07
农药在保护农作物免受有害生物侵害,保证其产量和质量方面起着举足轻重的作用。目前
新农药不断出现,同时又不断淘汰和限制了药效差、存在毒性和环境问题的部分农药品种的应
用,因此农药品种一直处于不断更新的动态发展中,在这种情况下新农药的创制开发成为世界
农药界竞争的焦点。然而由于新药登记严格的环境要求以及生物对农药抗性问题的加重,新农
药的创制变得越来越困难,约10万个化合物才有一个能转化为市场化的新农药[1]。但近年来
由于组合化学(combinatorialchemistry)在化学合成中的应用,使得化合物合成的速度大大提
高,一个公司年合成能力可达几十万个化合物,这样,被誉为新农药研究开发“眼睛”的生物筛
选(biologicalscreening)变得越来越重要。
除草剂是与人类生存活动密切相关的一类重要农药,自1942年美国的P.W.
Zimmerman和A.E.Hitchcock发现2,4-D的除草活性以来,除草剂工业飞速发展,在三大
类农药中,除草剂占的比例达47%之多[2]。除草剂的生物筛选是指利用各种生物测定技术从
大量合成的化合物中发现除草活性的新化合物的过程,筛选程序一般要经过室内初筛——盆
栽试验——田间试验三个步骤[3,4]。
除草剂的研发已有半个多世纪,用于除草剂生物筛选的生测方法有很多,并且不断有新的
方法被建立。世界各大农药公司也已建立了自成体系的规范化的筛选系统,并根据形势的发展
而不断进行改进与完善,原来的常规活体筛选现已发展到高通量筛选(high-throughput
screening简称HTS,也可称为high-throughputbioassayscreening,HTBS)甚至超高通量筛
选(ultrahigh-throughputscreening,UHTS)[1]。
1 常规筛选
常规筛选一般是利用生物活体作靶标,通过观察靶标生物对新化合物在生长发育、形态特
征、生理生化等方面的反应来判断新化合物的生物活性。除草剂的作用方式很多,如抑制光合
①作者简介:王树凤(1977-),女,山东潍坊人,硕士,目前在国家南方农药创制中心浙江基地从事新除草剂的生物筛选模式研究.作用、呼吸作用、细胞分裂,干扰蛋白质、脂类、叶绿素等的生物合成以及生长的激素控制等,因
此在进行除草剂活性初筛时,应根据新化合物的不同作用方式选择不同的靶标生物和相应的
筛选方法。特别是对于定向筛选而言,这一点尤为重要。常用作筛选的单子叶植物有稗草
Echinochloacrus-galliBeaur.、燕麦ArenafatuaL.、马唐Digitariasanguinalis(L.)Scop.、
小麦Triticummonococum、高粱Sorghumbicolor(L.)Moench,双子叶植物有油菜Brassica
napus、亚麻LinumustitatissimumL.、黄瓜CucumissativasL.、萝卜RaphanussativasL.和牵
牛花Ipormoeanil(L.)Roth等[5];在筛选技术方面,国内外也建立了许多用于筛选不同种类
除草剂的生物测定方法,主要有:培养皿法、小杯法、稗草胚轴法、高粱法、去胚乳小麦幼苗法、
玉米幼苗法、萝卜子叶法、浮萍法、绿藻法、黄瓜幼苗形态法、烟草叶片浸渍法等[5]。
对于随机合成的化合物,则必须要进行随机筛选或普筛。为了减少漏筛的几率,往往需要
将几种筛选方法联用。例如20世纪70年代我国有关研究单位开展了除草剂简易初筛方法的
研究,建立了高粱法、小球藻法和萝卜子叶法为主的筛选模式,将这3种方法联用,对所有试验
除草剂都有反应,且抑制生长50%的浓度均在100mg/L以下,因而可将上述方法联用作为简
易的初筛模式[3]。目前我国从事新农药创制的各个基地在进行除草剂筛选时,初筛主要是采用
培养皿法,也称种子萌发法,将选定的靶标生物的种子放入铺有双层滤纸的培养皿中,加入单
一剂量或3～5个梯度剂量的新化合物,然后放入人工气候箱中培养,7d后对种子的萌发率、
根或茎的抑制情况、鲜重等指标进行统计,计算抑制率为50%时的化合物浓度,从而判断化合
物是否出线。但研究发现[6],培养皿法对大部分光合作用抑制型除草剂难以检出。
常规筛选由于采用生物活体作靶标,包含生物体的全部信息,与在田间条件下获得的结果
更加接近,而且不容易漏筛,所以国外有些公司把某些作用较明确的新化合物直接进行常规药
效试验,而省略了第一步的生物活性初筛。但常规筛选由于受生物体本身生长规律的限制,筛
选周期比较长,一般为7d左右;其次,常规筛选的化合物用量比较大,而且对于那些溶解度
小、在植物体内传导性差的化合物需要助剂以使其均匀分布于植物表面,助剂的使用必然会影
响化合物的药效;另外,常规筛选的工作量也比较大,在人力、物力方面比较浪费。所有这些都
决定了常规筛选难以达到标准化、自动化、规范化的操作,因而限制了年筛选的化合物量。如采
用活体常规筛选,我国年筛选量仅1000～2000只化合物,国外大型农药公司也只有5000～
10000只化合物[7],这样的筛选速度远远不能适应组合化学合成的筛选。
2 高通量筛选
2.1 高通量筛选的产生
目前,国外越来越多的大农药公司在新农药研发中采用组合化学工艺,运用“液相机器人”
和固相自动化实现了化合物合成全自动化,包括制备、分离纯化、分析测试、实验数据记录及整
理、化合物注册存入数据库的全过程的自动化,使得化合物的合成速度大大提高,例如Zeneca农化公司的Zymark机器人系统一次运行可合成50～100个化合物,相当于一个专家组的工
作,一个公司年合成能力可达几十万个化合物[7]。组合化学具有高效率、多样分子合成的特点,
在短时间内可以合成成千上万个化合物,如果没有与之相适应的高效率筛选手段,组合化学无法发展,这就是高通量筛选得以发展的重要背景。这是一种将组合化学、基因组研究、生物信息4农 药 学 学 报Vol.4和自动化仪器、机器人等先进技术进行有机组合而形成的全新的高效筛选体系,使得国外大型
农药公司年筛选量由原来的5000～10000个化合物增加到了10万个化合物,其筛选效率提
高了10倍。特别是组合化学在新药发现中的地位确立以后,高通量筛选技术日益受到重视,发
展也很快。
2.2高通量筛选的技术关键
高通量筛选涉及到3种基本技术[8]:自动化技术、生物评价微量化技术和计算机软件技
术。
在自动化技术方面,国外已有很多产品。这些产品基本分为两大类型,一种是通用型设备,
如机器人手臂、自动移液器、微孔板读数计、震荡孵温仪、清洗器等,在工业筛选的常规性操作
中,几乎每一个步骤都已有自动化操作的仪器供选用。另一种自动化产品是组建型设备,即将
多种通用型单一操作仪组建成一个筛选系统。它与通用型设备最重要的差别是:它包含有已微
量化、敏感化的生物评价体系和相应的计算机软件系统。
在微量化技术方面,目前组建型的高通量筛选仪的生物评价体系可测定的信号包括:放射
性活性、颜色、发光和荧光等。测定的指标包括受体与配体的结合能力和细胞的功能状态,如细
胞内钙浓度、细胞内pH值、膜电位、膜的离子流动等。绝大多数高通量筛选仪采取多孔板形
式,其中96孔板是标准形式。为了追求更高通量的筛选或称超高通量筛选,很多研制生产单位
正在进一步使生物反应微量化、敏感化,使其能在更密集的孔板上进行。例如拜耳公司目前已
有用于液闪评价和发光酶报告基困评价(luciferasereportergeneassays)的384孔板;PE公司
和BD公司共同研制的共聚焦式高通量荧光筛选系统(FMAT8100)也可以通过定量检测384
孔板上的荧光强度来分析样品与不同先导物处理后的相互作用[9]。有的还在追求864孔板、
1536孔板的筛选方式,它们是否能成功,关键在于生物反应的微量化,但并不是所有的生物评
价法都可微量化,特别是操作仪器的精确度、收集器和滤板的微型化的问题,还得看它们能否
精确地操作极微量的生物样品。一般来讲[8],96孔板中每孔反应体系的总容积约100～
300μL,384孔板每孔反应体系容积可降至30～75μL,再微型化至864孔板、1536孔板,其反
应容积进一步减小,即使反应信号强度足够,但操作精度是否可行,尚须有相应的纳米技术予
以保证。但是从技术发展趋势上看,超高通量筛选的实现只是时间问题。
2.3 高通量筛选技术的应用除草剂的高通量筛选主要应用于除草剂的活性初筛阶段,对新化合物的生物活性作第一
次评价,有活体筛选和离体筛选之分。活体筛选用生物全体做靶标,利用组织培养技术实现格
式化、微型化、自动化和微量化,时间需要5～7d,容器缩小1/50～1/100,需要化合物量为毫
克或微克,操作及数据处理全部自动化。高效离体筛选是采用离体单细胞、酶、受体、细胞器或
基因组为靶标,利用化合物对靶标所参与的生理生化反应的抑制来判断化合物活性的有无。离
体筛选的数据分析系统也采用了先进的生化及生物工程技术手段如比色法、放射性同位素标
记法、全细胞启动基因记载法[7]等,并实现了数据自动分析处理等。但无论是活体筛选还是离
体筛选,其操作一般都是基于多孔板形式。
2.3.1 高效活体筛选 例如Zeneca公司[7]进行除草剂初筛时,在多孔板的每个微孔中注入
琼脂糖培养基(含单一剂量待测化合物),将杂草种子放入微孔中。测试板封好放入生长培养
箱,在合适的条件下培养7d,然后对植物的化学损伤和症状进行评价。但这种方法对光合作用No5.4王树凤等:除草剂生物筛选研究进展