小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验 【署名】 指导教师：于晓棠 【摘要】 目的：通过可移植性小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验，从感性上认识肿瘤侵袭与淋巴道转移的生物学特性，了解肿瘤动物实验模型建立的过程及意义。 方法：使用近交系615小鼠皮下接种腹水型肝癌高淋巴道转移菌株（HCa-F）进行肿瘤淋巴道转移实验，取其淋巴结观察是否有淋巴道转移以及检测瘤株淋巴结转移能力。取肺肝肾组织切片以观察是否有血道转移。 结果：小鼠腹水型肝癌发生淋巴道转移，转移率为40%，并可造成相关器官发生病变。 结论：此方法操作简单，结果直观，小鼠腹水型肝癌淋巴道转移率较高。 【关键词】小鼠 腹水型肝癌 淋巴道转移 【前言】 为更好地了解肿瘤的发病机制、肿瘤与宿主的关系、肿瘤侵袭与转移的过程和治疗措施的有效性,需要建立合适的动物模型。小鼠与人类在遗传学、病理学、生物学许多特性方面相似,是肿瘤研究的理想动物模型。而且目前的技术能够在鼠的基因水平上设计与人类疾病相关的基因突变而获得相关疾病模型[1]。小鼠模型是目前可以整合基础和临床肿瘤研究的武器[2],已应用于肿瘤研究的各个领域。随着对肿瘤认识的不断深入，以及实验动物学的发展和一些新技术的运用，小鼠肿瘤模型的研究取得了重要进展,并已得到广泛应用。 肿瘤转移是导致恶性肿瘤患者死亡的主要原因之一，淋巴结转移是癌早期最常见的转移方式，且淋巴转移还可以成为进一步血道转移的桥头[3]。小鼠腹水型肝癌淋巴道转移试验是研究肝癌的淋巴道转移的生物学特性的试验。因为新近流行病学资料表明，我国的原发性肝癌病人数占全世界肝癌病人的一半以上。由于乙型肝炎、肝炎后肝硬化病人众多，致使我国的肝癌发病率和死亡率居高不下，其死亡率占所有恶性肿瘤的第二位。在上个世纪我国进行大规模的现场筛查，通过早期发现早期治疗，在临床治疗方面取得了巨大进步，使肝癌有不治之症变成了部分可治之症。近来综合治疗技术的发展，大肝癌缩小后二部切除，又使部分病人获得了可治愈机会。随着临床治疗经验的积累，逐渐意识到及时是小肝癌根治性切除，转移复发仍然是一个十分严峻的问题。术后5年复发率可高达50%。解决这些问题，单靠临床经验、病例分析是远远不够的。要涉及到肝癌的实质性问题——肿瘤本身的生物学特性，尤其是其转移的生物学特性。对肝癌转移的生物学行为进行实验研究，必须有一个良好的转移模型系统。 HCa-F是从小鼠腹水型肝癌细胞株H22中筛选出的特异性向淋巴道转移的细胞，HCa-F为高转移细胞株，接种于615小鼠腋中线皮下淋巴结转移率高于80%[4][5]。本实验为感性上认识肿瘤侵袭与淋巴道转移的生物学特性，了解肿瘤动物实验模型建立的过程及意义提供了很好的帮助。 【正文】 方法： 一。实验材料： 1。细胞系：高转移力小鼠腹水型肝癌细胞，由大连医科大学病理教研室建株并保存。 2．实验动物：近交系615小鼠，雌雄兼用，6—8周龄，体重18—22g，由大连医科大学实验动物中心提供。 3。 主要仪器及器皿：搪瓷盆、温度计、离心管、1ml注射器、手术刀、眼科手术剪、眼科手术镊、乳胶手套、生理盐水、1%来苏儿溶液、75%酒精棉、10% 甲醛固定液等。 二。研究方法 1。细胞系获取：从液氮罐中取出高转移力小鼠腹水型肝癌细胞塑料冻存管，立即放入40度的温水中，一分钟内使冻存液全部融化，拉力机送入无菌室中。取出细胞悬液放入离心管中，有生理盐水洗涤2次，离心，弃上清，在加1ml生理盐水吹打均匀。向小鼠腹腔内接种0。2mlHCa-F细胞悬液，于第6天无菌条件取腹水。 2。615小鼠脚垫接种肿瘤细胞：取615小鼠癌性腹水0。1ml，接种于615小鼠脚垫上。定期观察肿瘤生长及淋巴结肿大情况。四周后处死全部小鼠，取瘤体及相关淋巴结，同时观察肺、肝、肾等器官。将上述组织固定于10%甲醛固定液中，石蜡包埋制片，HE染色，显微镜检查。 3。组织取材：将皮下瘤体、淋巴结、肺、肝、肾选取病变部位，切成厚2—3mm的小于2cm×1cm大小的组织块，10%中性甲醛固定。小块组织一般固定数小时，较大标本需固定24—48小时。经冲洗（用递升浓度的酒精等）、透明（用二甲苯等）、浸蜡（用石蜡），然后用石蜡将组织包埋成蜡块，再经切片机切片和染色制成切片。一般常规作苏木精-伊红染色。 4。切片脱色：石蜡切片法、HE染色法。 （1） 脱水程序及时间：组织固定，冲洗，然后： 1）脱水。以下列顺序进行：60%酒精30分钟→80%酒精1—2小时→95%酒精2—4小时或过夜→95%酒精2—4小时→100%酒精2—4小时→100%酒精2—4小时或过夜; 2）透明：二甲苯I30—45分钟；二甲苯Ⅱ30—45分钟; 3）浸蜡。蜡碗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（各30—45分钟）；包埋; 4）修蜡块。修蜡块，贴号; 5）切片; 6）烘烤。烘烤切片60—70摄氏度，1小时; 7）染色。 （2） HE切片染色程序与方法: 1) 切片脱蜡水洗： 将烘干的切片浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10分钟。 无水酒精5分钟（消除二甲苯）→95%酒精2分钟→80%酒精2分钟→70%酒精2分钟→50%酒精2分钟→自来水冲洗5分钟（洗去切片上的酒精，切片透明）→蒸馏水清洗（防止污染苏木精染液）。 脱蜡是水华过程，目的是通过酒精的缓冲作用，易于水洗与染色。因为染剂是谁，从无水酒精直接放入染液中，容易引起激烈的扩散作用，造成切片漂浮脱落或损伤组织。而经各级浓度酒精缓冲后即可避免发生这种现象。 2) HE染色： 苏木精-伊红染色是先用苏木精将组织切片适当的果然，经水洗后再用盐酸酒精分化，弱碱性水溶液显蓝。使胞核呈明显的蓝色，胞质及背景无色。再经水洗后用伊红染胞质，染成深浅不同程度的粉红色至红色。 苏木染色（染核）15分钟→自来水冲洗3分钟→0。5%盐酸酒精溶液分化数秒钟→自来水洗2分钟→弱碱性水溶液显蓝30-60秒→自来水冲洗5分钟→伊红1分钟→蒸馏水洗1-2次。 3) 脱水、透明、封固： 脱水、透明的目的是使存留在切片上的水分及漂浮的染色液全部除净，经透明剂的作用后，将脱水剂清除出来，使切片产生适宜的折光率。最后用盖玻片及封固剂封固，便于观察和长期保存。 80%酒精10秒→95%酒精10秒→无水酒精Ⅰ3分钟→污水酒精Ⅱ3分钟→二甲苯Ⅰ5分钟→二甲苯Ⅱ5分钟→中性树胶封固。 结果： 时间 精神状态 是否触及肿块 有肿块只数 10月22日 良好 否 0 10月24日 良好 否 0 10月27日 良好 否 0 10月29日 良好 否 0 10月31日 良好 否 0 11月3日 良好 否 0 11月5日 良好 否 0 11月7日 良好 否 0 11月10日 良好 是 5 11月12日 良好 是 6 11月14日 良好 是 6 11月18日 良好 是 6

显微镜下观察淋巴结转移的分布： 1。皮下瘤体： 大体：皮下瘤体较大，呈灰白色，质硬，与皮下组织粘附紧密，界限不清 LM：瘤细胞分布不规律（组织结构异型性），瘤细胞体积较大，形态不一，核较大，胞质蓝染，呈嗜碱性（细胞异型性）

2。同侧腋下淋巴结： 大体：比正常淋巴结大，呈卵圆形，质硬，切面灰白色 LM：在淋巴结边缘窦处可看到某些细胞分布不规律，细胞体积较大，形态不一，核较大，胞质蓝染，与在皮下瘤体的切片中看到的瘤细胞形态相似，表明此淋巴结中的肿瘤组织是原发在皮下的肿瘤经淋巴道转移的结果

3。肝 肺 肾 大体：未见异常 LM：未见到组织结构和细胞异型性，表明此肿瘤未经血道转移 讨论： 615近系小鼠是我国医学科学院血液学研究所1961年5月用本所饲养的昆明种白化雌性小鼠和由前苏联引进的C57BL血研黑色雄性近交系小鼠杂交而得到第一代后，用杂交第一代严格按照同胞兄妹交配的原则连续繁殖20代以上得到的一系棕色小鼠。由于615小鼠淋巴系统比较发达且有许多近交系，部分近交系有特定的自发性肿瘤，可利用其自发肿瘤与人体肿瘤的相似之处作为动物模型进行肿瘤发生、发展和治疗的研究。和国外的近交系小鼠相比，较易饲养繁殖，性情温顺，也适于实验肿瘤学，肿瘤病毒学的研究[7][8]。 近交系动物主要有如下的特点： ①基因纯合性，即基因型一致，遗传特性相同。从理论上说，不会因为隐性基因的暴露而影响实验结果的一致性。 ②遗传物质同源性。同一品系内的个体间的皮肤或肿瘤移植不会被当作异己来排斥，各个体间的基因位点，及位点的分型是完全一致的。 ③表现型的一致性，近交系动物任何可遗传的体征都应是一致的，如生理、生化以及组织学、形态学上的特征（毛色、体重等），甚至行为的类型都趋于一致。这一特点保证了动物实验数据在统计学上的意义。 由于近郊动物有以上优点，排除了一些对实验结果的不必要干扰。它具有良好的、适合实验要求的遗传特性，被用于众多的实验领域如胚胎学、生理学、遗传学研究等[9]。 人体内对抗癌细胞的功能主要由免疫系统承担。免疫系统被肿瘤细胞阻塞，淋巴液就会向相反的方向流动，导致不符合常规的转移现象。恶性肿瘤细胞转移的可能机制有：1、淋巴道转移 2、血道转移 3、种植性转移。本实验中重点研究淋巴道转移。恶性肿瘤侵入淋巴管后，首先到达局部淋巴结，局部淋巴结发生转移后，可继续转移至下一站的其他淋巴结，最后，可经胸导管入血再继发血道转移。 移植性小鼠肿瘤模型是人为因素制作的一种实验肿瘤类型，已被广泛应用与各种肿瘤的研究。小鼠腹水型肝癌（H22)瘤株可在多种品系小鼠身上移植生长，并发生淋巴道转移，具有瘤细胞易于计数，移植瘤生长良好，淋巴结转移高，肺转移率低等特点[6]。Hca-F是从小鼠腹水型肝癌细胞株H22中筛选出的特异性向淋巴道转移的细胞，Hca-F为高转移细胞株，淋巴结转移率高于80％。 转移率稍微偏低的原因分析如下：①瘤细胞接种时，可能因为操作不熟练，0。1ml（2×10^6个）未能全部注入皮下，造成瘤细胞数量过少。②实验动物数量过少，动物意外死亡等其他原因可造成转移率偏低。 淋巴道转移常有一定的规律，通常先是在局部呈膨胀性生长，并逐渐侵犯肌层、血管、神经，然后侵犯临近正常淋巴结，进行转移。淋巴道转移到晚期常合并血道转移。但实验时间如果短了，血道转移常不发生，这与本实验结果未见肺肝肾转移一致。 H22瘤细胞接种于皮下呈结节状增长。如H22一F20瘤细胞可在615系小鼠的脚掌、腋下等多个部位移植生长，并形成不同程度的转移，且主要沿淋巴系统转移，其中脚掌组转移的范围最广泛，数目也较多[10]。现很多肝癌淋巴道转移实验都采用脚垫接种。但浓度等均无统一标准， 缺乏特异的肿瘤淋巴道转移模型。作为恶性上皮肿瘤早期转移的主要形式，淋巴道转移机制的解析对临床肿瘤