第３３卷第９期　２０１３年９月　中南林业科技大学学报　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｓｏｕｔｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｖｌ０ｌ，３３　Ｎｏ．９　Ｓｅｐ．２０１３　

脂肪酶高产菌株的筛选及产酶条件优化　

夏宇　，周文化　，邓学良　，伍金娥　

（１．中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南长沙４１０００４；　２．稻谷及副产品深加工国家工程实验室，湖南长沙４１０００４）　

摘　要：为获得高产脂肪酶菌株，对包括白地霉在内的数十种微生物进行了筛选。在采用油脂培养基进行仞步　筛选之后，用酸碱滴定法对菌株所分泌的脂肪酶活力进行测定，筛选获得了高产脂肪酶的白地霉菌株，其酶活　力达ｌ０．７９　Ｕ／ｍＬ；然后对该菌株的产脂肪酶培养基配方、ｐＨ值、温度、摇床转速等条件进行优化，得到最适产　脂肪酶条件是：培养基配比的橄榄油２％、牛肉膏２％、蔗糖０．５％、（ＮＨ　）：ＳＯ　０．１％，最优培养条件为ｐＨ值７．０、　

温度２８℃、摇床转速２２５　ｒ／ｍｉｎ。　关键词：脂肪酶；白地霉；脂肪酶活测定；　菌株筛选；产酶条件　中图分类号：￥７１８．８；Ｑ９３６　文献标志码：Ａ　文章编号：１６７３—９２３ｘ（２０１３）０９一【）１　ｌ６—０５　

Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｉｇｈ　ｌｉｐａｓｅ—ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｓｔｒａｉｎｓ　ａｎｄ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　

ｌｉｐａｓｅ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　

ＸＩＡＹｕ　，ＺＨＯＵ　Ｗｅｎ—ｈｕａ　，ＤＥＮＧ　Ｘｕｅ—ｌｉａｎｇ　，ＷＵ　Ｊｉｎ—ｅ　

（１．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆＦｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｓｏｕｔｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ　４１０００４，Ｈｕｎａｎ，Ｃｈｉｎａ　２．Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｆｏｒ　Ｒｉｃｅ　ａｎｄ　Ｂｙｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｃｈａｎｇｓｈａ　４１０００４，Ｈｕｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ　ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｏｂｔａｉｎ　ｈｉｇｈ　ｌｉｐａｓｅ—ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｄｏｚｅｎｓ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｓｔｒａｉｎｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｃａｎｄｉｄｕｍ．Ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　ａｎｄ　ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｏｉｌ　ｍｅｄｉｕｍ，ｔｈｅ　ｌｉｐａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ａｃｉｄ—　ｂａｓｅ　ｔｉｔｒａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｈｉｃｈ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｍｏｒｅ　ｌｉｐａｓｅ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ａｔ　ｌａｓｔ，ｏｆ　ｔｈｅｍ　Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｃａｎｄｉｄｕｍ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗａｓ　ａｌｓｏ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｏｕｔ，ｗｈｏｓｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｗａｓ　ｕｐ　ｔｏ　１０．７９　Ｕ／ｍＬ．Ｔｈｅｎ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｌｉｐａｓｅ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ．　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ　ｃｏｎｔａｉｎｅｄ：ｏｌｉｖｅ　０ｉｌ　２％，ｂｅｅｆ　ｅｘｔｒａｃｔ　２％，ｓｕｃｒｏｓｅ　０．５％，（ＮＨ４）２ＳＯ４　０．１％．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｃｕｌｔｉｖａｔｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ：ｐＨ　７．０，２８￣Ｃ，２２５　ｒ．ｍｉｎ～。　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｌｉｐａｓｅ；Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｃａｎｄｉｄｕｍ；ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ；ｓｔｒａｉｎ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ｌｉｐａｓｅ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　

脂肪酶是一类应用广泛且十分重要的工具酶，　

它能将油脂的甘油三酯催化生成脂肪酸、甘油和　

甘油单酯或二酯。利用脂肪酶作用于脂肪释放出　来的短链脂肪酸可以增加和改进食品风味；利用　

脂肪酶催化醇解和酯化反应可以生产各种香精酯；　用专一性微生物脂肪酶可以提高食用油营养价值　

和增加食用油花色品种，并可以制备代可可酯；　

另外，脂肪酶还可用在酒类去浊除渣、改善面包　质量、改善蛋白发泡等方面【ｌ】。　

目前国内外用于获得脂肪酶的方法主要是微生　

物发酵法，然而选用的产脂肪酶微生物品种质量层次　不齐，适合工业化生产的高产脂肪酶微生物菌种更是　极度缺乏。本研究为获得脂肪酶高产菌株，对众多可　能产脂肪酶的微生物进行了筛选。在获得脂肪酶高产　

菌株后，为了使高产菌株的脂肪酶产量最大化，进一　步探索其产酶的最适条件，如培养基的配方、最适温　度、ｐＨ值等［２－７］ｏ本研究筛选出的脂肪酶高产菌株可　

以用于工业上生产脂肪酶，探索得到的最适产酶条件　

则可以指导科学生产，提高产量，增加效益。　

１材料与方法　

１．１材料　

实验所用的菌株均来自于武汉工业学院食品　

收稿日期：２０１３—０１—１４　基金项目：湖南省农业科技成果转化项目（２０１３ＮＫ２００１）　作者简介：夏宇（１９９０一），男，湖北十堰人，硕士研究生，主要研究方向为农产品加工与安全；Ｅ－ｍａｉｌ：５２７８１８４４３＠ｑｑ．ｃｏｒｎ　通讯作者：周文化（１９６９．），男，湖南常德人，教授，博士，博士生导师，主要从事食品科学教学与研究工作；　Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈｏｗｅｎｈｕａ＠１２６．

ｃｏｍ　第３３卷　中南林业科技大学学报　ｌ１７　

学院微生物实验室保藏的现有菌株。　

（１）培养基：Ａ）ＰＤＡ培养基。即马铃薯葡萄　糖琼脂培养基。Ｂ）种子培养基。配方：蛋白胨２０　

ｇ，酵母提取物５　ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４　２　ｇ（或者Ｋ２ＨＰＯ４－３Ｈ２ｏ　

２．６２　ｇ），ＭｇＳＯ４＂７Ｈ２Ｏ　０．０５　ｇ，花生油２０　ｍＬ，去　

离子水１　Ｌ。Ｃ）油脂培养基（ｐＨ值７．２左右）。　

配方：蛋白胨１０　ｇ，牛肉膏５　ｇ，ＮａＣ１　５　ｇ，花生　油或香油１０　ｇ，１．６％中性红水溶液１　ｍＬ，琼脂　

ｌ５～２０　ｇ，去离子水１　Ｌ。Ｄ）产（脂肪）酶培养　基。配方：蛋白胨２０　ｇ，蔗糖５　ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４　１　ｇ，　

Ｋ２ＨＰＯ４　１　ｇ，ＭｇＳＯ４＂７Ｈ２Ｏ　０．５　ｇ，花生油２０　ｍＬ，　去离子水１　Ｌ。　

（２）主要试剂：Ａ）ＰＢＳ溶液（磷酸盐缓冲　

溶液）；　Ｂ）ＮａＯＨ标准溶液。　

（３）ＰＶＡ溶液（体积分数为２％）：配制所　

采用的药品为ＰＶＡ——聚乙二醇６００。　

（４）油脂底物溶液：量取２％ＰＶＡ溶液１５０　

ｍＬ，加入纯净优质的橄榄油５０　ｍＬ，用磁力搅拌　器（８５—２型恒温磁力搅拌器）进行快速搅拌以充　

分乳化。现配现用。　

（５）粗酶液的制取：从产酶培养基中取培养　

液７　ｍＬ置于１０　ｍＬ的离心管中，在离心机中以　

４　０００ｒ／ｍｉｎ的转速离心１５　ｍｉｎ后取上清液１　ｍＬ待用。　

１．２　仪器与设备　

试验用仪器和设备见表１。　

表１试验用仪器和设备　Ｔａｂｌｅ　１　Ｔｅｓｔ　ａｐｐａｒａｔｕｓ　ａｎｄ　ｄｅｖｉｃｅｓ　

仪器设备　制造单位　３２０．Ｓ酸度计　宜兴市高塍江南设备厂　ＨＨ一２数显恒温水浴锅　国华电器有限公司　ＤＮＰ．９０２５型电热恒温培养箱　上海精密实验设备有限公司　ＳＷ－ＣＪ．１ＦＤ型单人单面净化工作台　苏州净化设备有限公司　８５．２恒温磁力搅拌器　巩立市英峪予华仪器厂　ＧＺＸ一９１４０ＭＢＥ数显鼓风干燥箱上海博迅实业有限公司医疗设备　ＴＤ．５Ｇ台式低速离心机　上海亚荣生化仪器厂　ＹＸ２８０Ｂ高压灭菌锅　上海三申医疗器械有限公司　

１．３　实验方法　

１．３．１产脂肪酶菌株的富集培养及初筛　将食品学院微生物实验室保藏的一批现有菌　

株（霉菌），包括青霉、曲霉、根霉、白地霉、毛霉、　

黑曲霉等，接种到ＰＤＡ培养基上进行活化。　

将获得的菌株接种到ＰＤＡ培养基上进行活化　培养，２８℃培养４８　ｈ后取出观察，菌落要求生长　

茂盛，没有杂菌污染。将纯化菌株划线接种到油　脂培养：基上，在霉菌培养箱２８℃培养４８　ｈ。由于　

油脂培养基中有中性红，因此培养基平板呈现暗　红色。观察生长出来的菌落周围的颜色，若出现　

透明圈，则说明该菌株产生并分泌了脂肪酶，将　

自身周围的油脂进行了分解。　

１．３．２产脂肪酶菌株的复筛　

初筛培养后得到了产脂肪酶菌株，根据透明　圈直径的大小将透明圈较大较明显的菌株转接到　

灭过菌的种子培养基中，在２００　ｒ／ｍｉｎ、２８±２℃条　件下用摇床培养２４　ｈ。　

然后对经过种子培养液培养的每种菌，各取　

１　ｍＬ种子培养液转接到灭过菌的产酶培养基中，　

在２２５　ｒ／ｍｉｎ、２８±２℃条件下用摇床培养７２　ｈ。　１－３－３　脂肪酶活力的测定［５－８］　

取２个锥形瓶，分别作为空白瓶（Ａ）和样　

品瓶（１３），各加入底物溶液４．００　ｍＬ和磷酸缓冲　

液５．００　ｍＬ，再于Ａ瓶中加入９５％的乙醇ｌ５．ｏ０　

ｍＬ，２瓶置于３５±０．２℃的水浴锅中加热５　ｍｉｎ，　

然后于Ａ、Ｂ　２瓶中各加入待测酶液１．００　ｍＬ，立　即混匀计时，在３５±０．２℃的水浴锅中准确反应１５　

ｍｉｎ，于Ｂ瓶中立即补加９５％的乙醇１５．００　ｍＬ，　

使反应终止。取出后，在２瓶中各加入酚酞指示　

剂２滴，用配制并标定好的约０．０５　ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ　

标准溶液进行滴定，直至出现微红色并保持３０　Ｓ　不退色为其终点，记录消耗的ＮａＯＨ标准溶液的　

体积。平行实验测定３次，保证３次测定的结果　

相差不超过０．５％。　

酶活性的计算公式为：　

１０００‘ｎ（Ｚ—Ｖｏ）Ｃ／ｒ。　式中：　为脂肪酶酶活力，Ｕ／ｍＬ；Ｖ为滴定样品　

组平均消耗的ＮａＯＨ标准溶液的体积，ｍＬ；Ｖｏ　

为滴定：空白组平均消耗的ＮａＯＨ标准溶液体积，　

ｍＬ；Ｃ为ＮａＯＨ标准溶液的浓度，ｍｏｌ／Ｌ：　为初　

酶液的稀释倍数，１０；Ｔ为反应时间，１５　ｍｉｎ；　１　０００为ＮａＯＨ标准溶液的毫摩尔浓度与微摩尔浓　

度的换算系数。　

脂肪酶活力单位定义为：１　ｍＬ酶液于温度　

３５℃、ｐＨ值７．５的条件下，水解脂肪每分钟产生　

１　ｇｍｏｌ脂肪酸，以Ｕ／ｍＬ表示。用橄榄油乳化法　对脂肪酶活力进行测定，记录下消耗的ＮａＯＨ标　

准溶液的体积。　

１．３．４　产酶菌株的初步鉴定　将筛选出来的脂肪酶高产菌株接种到ＰＤＡ平　

板上以观察菌落的形态、生理生化特征，并做微　生物显微镜涂片观察。对照微生物学实验手册ｎ　０］　

进行初步鉴定。