DNA分离核酸包括DNA、RNA两种分子在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在。

真核生物的染色体DNA为双链线性分子；原核生物的"染色体"、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子；有些噬菌体DNA有时为单链环状分子；RNA分子在大多数生物体内均是单链线性分子；不同类型的RNA分子可具有不同的结构特点，如真核自由RNA分子多数在3'端带有ploy(A)结构。

至于病毒的DNA、RNA分子，其存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线状和单链线状等。

95%的真核生物DNA主要存在于细胞核内，其它5%为细胞器DNA，如线粒体、叶绿体等。

RNA分子主要存在于细胞质中，约占75%，另有10%在细胞核内，15%在细胞器中。

RNA以rRNA 的数量最多(80%~85%),tRNA及核内小分子RNA占10%~15%，而mRNA分子只占1%~5%，mRNA分子大小不一,序列各异。

总的来说，DNA分子的总长度一般随着生物的进化程度而增大，而mRNA 的分子量与生物进化无明显关系。

分离纯化核酸总的原则：①应保证核酸一级结构的完整性；②排除其它分子的污染。

为了保证核酸结构与功能的研究，完整的一级结构是最基本的要求,因为遗传信息全部贮存在一级结构之内。

核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其它生物大分子结合的方式。

核酸的纯化应达到的要求：①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时,应去除RNA分子，反之亦然。

实验过程中注意事宜: ①尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；②减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4~10条件下进行；③减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。

机械剪切力包括强力高速的溶液震荡、搅拌,使溶液快速地通过狭长的孔道；细胞突然置于低渗液中；细胞爆炸式的破裂以及DNA样品的反复冻贮。

这些操作细节在实验操作中应备加注意。

机械剪切作用的主要危害对象是大分子量的线性DNA分子，如真核细胞的染色体DNA。

对分子量小的环状DNA分子，如质粒DNA及RNA分子,威胁相对小一些。

高温,如长时间的煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的有些化学键也有破坏作用。

核酸提取过程中,常规操作温度为0~4℃,此温度环境降低核酸酶的活性与反应速率,减少对核酸的生物降解；④防止核酸的生物降解，细胞内或外来的各种核酸酶消化核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。

其中DNA酶,需要金属二价离子Mg++的激活,使用金属二价离子整合剂乙二胺四乙酸(EDTA)、拧檬酸盐,基本上可以抑制DNA酶的活性。

而RNA 酶，不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱、不易失活,所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。

核酸提取的主要步骤，无外乎破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其它不需要的核酸分子，沉淀核酸,去除盐类、有机溶剂等杂质,纯化核酸等。

核酸提取的方案，应根据具体生物材料和待提取的核酸分子的特点而定。

对于在某特定细胞器中富集的核酸分子，事先提取该细胞器，然后再提取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。

实验1 样品处理～白细胞分离制备采血液～0.5ml→加红细胞裂解液0.8ml→混匀，3000r/min～5000/min离心5min→弃去上清液→再加红细胞裂解液0.5ml→混匀，重复离心5分钟→如此重复数次，直至沉淀为白色（白细胞）备用。

或取l ml新鲜抗凝血1500rpm离心l0min弃血清。

加入3~4倍体积的红细胞溶解液(RCLB) [10mmol/L Tris-Cl(pH7.6), 5mmol/LMgCl2, 10mmol/L NaCl]，3500rpm离心l0 min, 重复3次收集白细胞(白色沉淀)[若用生理盐水洗涤，再加入固定液(甲醇:醋酸为3:1), 可长期保存，用生理盐水洗涤白细胞, 除去固定液，即可提取DNA]。

或2ml冻藏血中加入2ml PBS(PBS(0.8% NaCl、0.02% KCl、0.144 %Na2HPO4、0.024% KH2PO4、pH7.4), 混匀,3500rpm 离心l0min，弃去上清。

加入2ml RCLB混匀,3500rpm离心l0min,弃上清，重复1~2次，收集白细胞(白色沉淀)。

实验2 基因组DNA的提取分离一、实验目的了解DNA的存在状态，增加感性认识，学习、掌握DNA的制备一般方法技术。

二、实验原理利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。

加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA 即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。

在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。

一般来说,构建基因组文库, 初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。

而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。

不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。

在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。

尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。

各种生物材料的细胞核含有丰富的DNA，是提取DNA的好材料。

制备过程中，为了防止DNase的作用，在用于提取的缓冲液中均含有1mmol/L的EDTA（乙二胺四乙酸）螫合剂，以除去保持DNase活性所必须的Mg++离子。

为防止DNA的变性和降解，操作要尽可能在低温下进行。

三、实验步骤分离的白细胞↓提取DNA加2.5倍(W/W)DNA提取液（pH8.3的0.2molL-1的Tris缓冲液，内含0.25molL-1NaCl 0.025 L-1 EDTA和0.5%SDS）↓↓充分混匀3-5min加0.3ml 60℃热饱和酚（1mol L-1 Tris.HCl pH8.0）↓充分混匀3min加0.2ml氯仿：异戊醇（24：1v/v）↓充分混匀3min4℃离心(10kr/min)，15-20 min仔细小心的收集上层水相到另一1.5ml离心管中↓加等体积氯仿：异戊醇（24：1v/v），4℃离心(10kr/min)，15-20 min收集上层水相到另一管中↓加1/3体积的3mol醋酸钠（pH 5.2）和1/2体积的异丙醇，轻轻倒置混匀↓取出DNA细丝↓↓加70%乙醇↓离心2 min得DNA白色沉淀↓加70%乙醇↓离心2 min重复洗涤3次↓真空干燥（-40℃/-70℃保存）或室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后，保存。

或向沉淀的白细胞中加入0.5ml白细胞溶解液(WClB)[l0rnmol/LTris-Cl(PH7.6)，l0mmol/LEDTA，50mmol/LnaCl]。

溶解白细胞，再加入蛋白酶K(终浓度达100μg/μl), SDS(终浓度0.5%)，RnaseA(终浓度20μg/ml)。

42℃保温过夜(其间轻轻摇晃多次)，60℃保温1h。

或加入0.5ml抽提缓冲液[10mmol/L Tris-Cl(pH8.0)，0.lmmol/LEDTA(pH8.0)，0.5%SDS，20μmol/L RnaseA]，42℃保温过夜。

然后加入苯酚:氯仿(1:1)混合液，旋转20分钟，3500rpm离心10min，小心吸取上清液，转移至无菌的Eppendorf管中, 重复1~2次，加入氯仿:异戊醇(24:1)抽提2次, 3500rpm离心l0min，除去苯酚。

吸取上清液，加入等体积的冷异丙醇(或2倍体积的冷乙醇)，颠倒几次，沉淀析出絮状DNA，用无菌玻璃棒挑出DNA，在70~75%的乙醇中洗涤2次，除去异丙醇。

抽真空干燥至无乙醇气味。

－20℃冰箱保存备用。

实验3 真核RNA的分离提取一、实验目的了解RNA的存在状态，增加感性认识，学习、掌握RNA的制备一般方法技术。

二、实验原理RNA提取与DNA提取在技术路线上有许多相同的地方，如组织破碎、核酸酶的抑制、RNA与蛋白质或次生代谢产物所形成的复合体的有效分离等。

但是，RNA提取比DNA提取更需特别小心，因为只要存在有极微量的RNA酶就可能降解RNA。

此外，水溶性细胞次生代谢产物如多糖、多酚，在RNA提取过程中易与RNA结合形成粘稠难溶的胶冻状复合物而导致RNA的大量损失，或与RNA形成褐色复合物导致RNA完全无生物不活性。

传统方法通常采用去污剂，如SDS或CTAB或用LiCl沉淀法，或用热与冷酚抽提，或用胍基化合物并结合CsCL密度梯度离心，或单用胍基化合物，或用蛋白酶K，或综合以上方法中的部分处理办法等。

现成的总RNA提取试剂盒，可快速有效地提取到高质量的总RNA。

分离的总RNA可在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

RNA分子的结构特点，容易受RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键。

所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。

所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。

凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理，再用蒸馏水冲净。

DEPC是RNA酶的化学修饰剂，它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。

DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物，因而使用时需小心。

试验所用试剂也可用DEPC处理，加入DEPC至0.1%浓度，然后剧烈振荡10分钟，再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC，否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。

但DEPC 能与胺和巯基反应，因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。

Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。

配制的溶液如不能高压灭菌，可用DEPC处理水配制，并尽可能用未曾开封的试剂。