北京化工大学分子生物学实验指导实验一 少量质粒DNA的制备一、实验目的（1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。

（2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。

（3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。

二、实验原理质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传得因子。

质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。

从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。

根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。

目前，质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。

在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。

质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringent control）复制型和松弛控制型（relaxed control）复制型。

严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。

每个细胞内只含1个或几个质粒分子（即有1个或几个拷贝）。

松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。

该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如col E1 质粒（含有产生大肠杆菌素E1 基因）及其衍生质粒，在每个细胞内约有20多个拷贝。

所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。

目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱层析套管法等。

最常用的碱裂解法具效率高、价廉、简单易学等优点。

其原理是利用碱处理质粒DNA及染色体DNA，使两者双股打开呈单股状态，再加酸中和，使单股回复为双股DNA，同时在急速中和反应中，染色体DNA因分子过于庞大以致于碱基匆忙配对，形成杂乱无序的巨大分子，对水的相对溶解度低而易被沉淀下来。

相反，质粒DNA因分子小，两单股DNA恢复原碱基配对快而易溶于水中，所以只要经过离心，即可将染色体DNA与质体DNA分离。

本实验所使用的pUC19含有β-lactamase基因，会产生peripasmic酶，进行蓝白斑筛选，抗氨苄青霉基因ampicillin (Amp)两种抗性筛选标记。

碱裂解法：本实验是以alkaline lysis的方法进行，其原理是将大肠杆菌以NaOH及SDS分解，并使蛋白质及DNA变性，然后以酸中和。

小分子质粒DNA在中和后可恢复原状，但大部分的大肠杆菌染色体DNA则无法完全复原而与SDSD-K+所含复合物一起沉淀下来，可离心去除，上清液所含质粒则可以乙醇(ethanol)或异丙醇(isopropanol)将其沉淀下来。

三、实验方法1.仪器用具:a.无菌操作台(laminar flow)b.台式型离心机(microcentrifuge)c.微量吸管(pipetman)d.真空干燥机(speed vac)e． 漩涡混合器f． 琼脂糖凝胶电泳仪2.材料:实验前一天，将含质粒的大肠杆菌接种至含ampicillin (50 μg/ml)的LB培养液中，并在37 o C下振荡培养过夜。

3.药品及试剂:a.Solution I: 25mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM glucoseb.Solution II: 0.2M NaOH, 1% SDS (使用前以10 N NaOH与10% SDS稀释配制)c.Solution III: 3M醋酸钾溶液(KAc, pH 5.2)d.RNase A: 1mg/mle.TE buffer: 10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)f.100% 乙醇(ethanol)或异丙醇(isopropanol)g.LB(Luria-Bertani)培养液: 10g tryptone, 5g yeaste extract, 10g NaCl in 1Lh．酚/氯仿（1：1）溶液i．1 x TAE电泳缓冲液：40 mM Tris-乙酸, 1mM EDTA（pH 8.0）j .DNA mark er：DL20004.实验步驟:1)将过夜菌液分別倒入1.5ml微量离心管中以10,000 rpm离心1分钟后，倒去上清液。

2)沉淀菌体加入50 μl Solution I，用漩涡混合器剧烈振荡使菌体完全悬浮，置于冰上5分钟。

3)加入100 μl Solution II，盖上管盖后将管子反复上下摇动3次，不可剧烈振荡，置于冰上5分钟。

4)加入75 μl Solution III，亦温和摇匀，置于冰上5分钟。

5）加等体积酚：氯仿(1:1)225 μl混匀。

6)以12,000 rpm 离心5分钟，小心吸取上清液至另一微量离心管中。

7)加入2倍体积100% 酒精，混合均匀，置于冰上20分钟。

8)以12,000 rpm 离心8分钟，倒掉上清液，加入70% 酒精清洗一次，置于真空干燥机中10分钟。

9)加入15ul灭菌水，溶解DNA。

10）电泳检测（琼脂糖凝胶电泳），取5μl DNA溶解液加2μl Loading buffer于1%琼脂糖,电泳半小时,电压80伏。

11）电泳凝胶在透射式紫外检测仪上观察，记录结果。

四、注意事项1．细菌培养过程要求无菌操作。

抗菌素等不能高温灭菌，应使用细菌滤器过滤后使用。

细菌培养液、配试剂用的蒸馏水、试管和Eppendorf离心管等有关用具和某些试剂须经高压灭菌处理。

接触过细菌的器具用后应消毒灭菌再洗净。

2．制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡，以避免机械剪切力对DNA的断裂作用。

同时也应防止DNase引起DNA的降解。

3．酚氯仿有强腐蚀性，使用时要格外小心，不要弄到手上，必要时带手套。

4．加入乙酸钾溶液后，可用小玻璃棒轻轻搅开团状沉淀物，防止质粒DNA可能被包埋在沉淀物内，不易释放出来。

5．用酚/氯仿混合液除去蛋白效果比单度作用酚或氯仿更好。

为充分除去残余的蛋白质，可以进行多次抽提，直至两相间无絮状蛋白沉淀。

6．提取的各步操作尽量在低温条件下进行（冰裕上）。

7．电泳时，电泳缓冲液要没过凝胶。

8. 在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。

所以，多数 质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA（cccDNA）： 质粒的两条链没有断裂；超螺旋开环DNA（ocDNA）： 质粒的一条链断裂；松弛的环状分子线形DNA（lDNA）： 质粒的两条链均断裂；线性分子质粒DNA的形态不一，电泳时在凝胶中的迁移率不同。

超螺旋的质粒DNA一般迁移最快、开环（缺口）质粒DNA迁移最慢，线化DNA位于两者之间。

本实验采用绿色荧光蛋白（GFP）对DNA进行染色，电泳显示有些脱尾，绿色荧光部分有一大片，可能是把染料直接加到质粒DNA中所致，所以我又将胶用EB（溴化乙锭）染色，紫外线照射下呈桔红色荧光，可由上图清除看到质粒DNA所在位置。

(a)松弛线性的DNA；(b)松弛开环的OC构型；(c)超螺旋的SC构型实验二 PCR反应一、实验目的1、学习PCR 反应的基本原理与实验技术。

2、了解引物设计的一般要求。

二、实验原理聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）是体外酶促合成特异DNA片断的一种技术。

利用PCR技术可在数小时之内大量扩增目的基因或DNA片断，从而免除基因重组和分子克隆等一系列繁琐操作。

由于这种方法操作简单、实用性强、灵敏度高并可自动化，因而在分子生物学、基因工程研究以及对遗传病、传染病和恶性肿瘤等基因诊断和研究中得到广泛应用。

PCR进行的基本条件是：（1） 以DNA为模板（在RT-PCR中模板是RNA）；（2） 以寡聚核苷酸为引物；（3） 需要4种dNTP 作为底物；（4） 有 Taq DNA 聚合酶。

PCR 每一个循环由三个步骤组成：（1） 变性 加热模板DNA，使其解离成单链；（2） 退火 降低温度，使人工合成的寡聚核苷酸引物在低温条件下与模板DNA 所需扩增序列结合；（3） 延伸 在适宜温度下，DNA 聚合酶利用dNTP 使引物3’端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互补的DNA链。

每一个循环产物可作为下一个循环的模板，因此通过35-45个循环后，目标片断的扩增可达106-107倍。

本实验扩增的片段约1.3kb，故需用LA Taq TM 扩增长片段。

三、 实验方法1、仪器用具：a．PCR 扩增仪b．琼脂糖凝胶电泳仪2、药品及试剂a．LA Taq TM（5U/μl）购于Takarab.10×反应缓冲液：0.67mol/l，pH = 8.8 Tris-HCl,0.067mol/l MgCl2，0.166mol/l （NH4）2SO4c.dNTP(2.5mM)d.引物P1，P23、实验步骤1）PCR扩增体系在150μl离心管中按体积有大到小加入下列试剂，最后加酶：模板 0.5μl引物P1 0.5μl引物P2 0.5μldNTP 3 μl10×buffer 2.5μlLA Taq 0.5μlO 17.5μlddH2Total 25 μl2）扩增程序预变性 94℃ 5min变性 94℃ 30s30个循环退火 43℃ 30s延伸 72℃ 2min末端延伸 72℃ 10min保存 16℃ 8h3）PCR产物电泳检测 反应结束后，取5μl PCR 产物用1% 的琼脂糖凝聚电泳检测，用GLP 在紫外灯下检测。

四、注意事项1、在加入各试剂时要先加体积大的试剂，再加体积小的试剂，并充分混合。

2、加Taq酶时要拿管的上部，避免用手触摸酶的部分。

3、PCR的影响因素：（1）模板 单、双链 DNA 都可作为PCR的模板，若起始材料是RNA，需先通过逆转录反应得到一条cDNA。

虽然PCR 可以用极度微量的样品甚至是来自于单一细胞的DNA，但为了保证反应得特异性，一般宜用ng级的克隆DNA，μg水平的染色体DNA 或104拷贝数量的待扩增片断来作起始材料。

原料可以是粗制制品，但不能混有蛋白酶、核酸酶、Taq DNA 聚合酶抑制剂以及任何能结合DNA 的蛋白质。