Lipofectamine ® 3000—用于生物学相关性细胞模型的高效、可重复转染Nektaria Andronikou, Xin Yu, Jia Wei, Mahalakshmi Sridharan, Rene Quintanilla, Uma Lakshmipathy, Peter Welch, Xavier de Mollerat du Jeu Life Technologies, 5791 Van Allen Way, Carlsbad, CA 92008新技术22种细胞系难以转染 (<40%)扩大细胞检测板扩大细胞检测板应用Lipofectamine ®3000137个iPSC 集落109个iPSC 集落LNCaPA549HepG2Lipofectamine ® 3000HEK 293HeLaLipofectamine ® 2000FuGENE ® HD120%10 nM 30 nM80%20%N o t r a n s f e c t i o n N o t r a ns f e c t i o n N o t r a ns f e c t i o n R N A i M A X R N A i M A X R N A i M A XL i p o f e c t a m i n e ®2000L i p o f e c t a m i n e ®2000L i p o f e c t a m i n e ®2000L i p o f e c t a m i n e ®3000L i p o f e c t a m i n e ®3000L i p o f e c t a m i n e ®3000100%% 剩余表达量40%60%0%143B HEK 293MCF-7细胞类型细胞类型3 µL Lipofectamine ®2000 3 µL Lipofectamine ®20001.5 µL Lipofectamine ®3000 1.5 µL Lipofectamine ®3000200,000200,000150,000150,00050,00050,000100,0000平均O F P 强度平均O F P 强度U2OSHepG2AABBB% 基因修饰效率% 基因修饰效率T A L sC R I S P RT A L sC R I S P RLipofectamine ®2000Lipofectamine ®3000bp 500400300200100ApcDNA™3.3 control640500400300200T A L sC R I S P RT A L s C R I S P RLipofectamine ®2000Lipofectamine ®3000Bbp pcDNA™3.3 controlCDLipofectamine ® 3000Neon ® 转染系统简介随着更具生物学相关性的细胞模型研究领域的不断扩展，我们需要提升现有的分子和细胞技术。
Lipofectamine ® 3000是一种全新的转染试剂，可提升输送效率并实现新技术的应用，适用于相关度更高的系统，且可以更快地获得更可靠的结果。
基因组编辑、干细胞操作和免疫治疗领域发展迅速，它们需要利用更先进的技术实现应用潜能最大化。
与目前商品化的脂质介导的转染试剂相比，Lipofectamine ® 3000用于各种细胞系的性能均有大幅提升。
更重要的是，Lipofectamine ® 3000有助于推动诸多令人激动的新技术的发展。
采用EmGFP 重组体在22种难以转染的细胞系中对新技术进行筛查并利用流式细胞仪进行分析。
难以转染的细胞系定义为转染效率低于40%的细胞系。
在更多细胞检测板中优化并重新检测靶标。
进一步优化，确保使用新开发的Lipofectamine ® 3000可以获得可重复且可靠的结果。
Lipofectamine ® 3000转染实验方案使用简单，且仍然可以确保在各种细胞系中获得最佳性能和可靠性。
方法图1. 鉴别Lipofectamine ® 3000的策略。
结果图3. 在各种细胞系中的转染效率和蛋白表达。
Lipofectamine ® 3000试剂用于iPSC 重编程。
图4. 输送siRNA 用于基因抑制。
图5. 在H9胚胎干细胞中的转染。
实验方案图2. 适用于各种细胞系的简单的升级版转染实验方案。
配方络合验证大规模应用首选的候选产品进一步优化的实验方案时 间第0天第1天第2-4天涡旋振荡2–3秒步 骤接种细胞至70–90%汇合度时转染使用Opti-MEM ®培养基稀释Lipofectamine ® 3000试剂-充分混匀使用Opti-MEM ®培养基稀释DNA ，制备DNA 预混液，然后添加P3000®试剂-充分混匀在每管已稀释的Lipofectamine ® 3000试剂中加入稀释的DNA (1:1比例)加入DNA-脂质体复合物至细胞中显示/分析转染细胞孵育使用各种试剂在96孔板中转染HEK 293、HeLa 、LNCaP 、A549和HepG2细胞，转染48小时后分析GFP 表达。
在全部五种细胞系中，Lipofectamine ® 3000试剂均可提供较Lipofectamine ® 2000和FuGENE ® HD 试剂更高的GFP 转染效率。
细胞培养和转染条件。
在推荐条件下使用Neon ®转染系统，每孔加入3.6 µL Lipofectamine ® 3000，转染BJ 成纤维细胞。
使用Epi5™附着体iPSC 重编程载体(货号：A14703)。
遵循下列实验方案每日更换培养基：使用附着体载体从成纤维细胞生成人诱导多能性干细胞 (hiPSC) (参见表1)。
Lipofectamine ® 3000是一种通用型试剂，利用相同的转染实验方案亦可用于输送siRNA 。
只需用siRNA 替代DNA 。
在本实验中，采用Lipofectamine ® 3000、Lipofectamine ® 2000和Lipofectamine ® RNAiMAX 在三种改造的萤光素酶细胞系中完成内源性萤光素酶的抑制。
将试剂与特定siRNA 剂量的靶向萤光素酶的Silencer ® Select siRNA 结合。
使用Lipofectamine ® 2000和Lipofectamine ® 3000，在96孔板中转染H9人胚胎干细胞。
转染24小时后进行GFP 表达分析。
表1. 培养和转染条件图6. 重编程结果图8. AAVS1安全港基因座的基因组剪切检测。
图7. 采用GeneArt ® CRISPR 核酸酶载体试剂盒进行基因组修饰。
利用明场显微镜观察 (A) Lipofectamine ® 3000和(B) Neon ®转染系统，结果显示生成iPSC 集落时成功完成了重编程。
采用红色的碱性磷酸酶进行终极染色，集落计数如(C)和(D)所示。
详细的培养实验方案可登录一体式GeneArt ® CR ISPR 载体系统包含一个Cas9核酸酶表达框和一个靶向AAVS1安全港基因座的向导RNA 克隆表达框；下游的橙色荧光蛋白(OFP)基因有助于确定输送效率，也可用于富集。
使用Lipofectamine ® 2000和Lipofectamine ® 3000，在12孔板中转染U2OS 和HepG2细胞。
转染72小时后分析转染效率和OFP 表达，结果显示使用Lipofectamine ® 3000，(A) U2OS 和 (B) HepG2细胞分别提升4倍和80倍。
使用GeneArt ®基因组剪切检测试剂盒测定剪切效率。
使用Lipofectamine ® 2000和Lipofectamine ® 3000，在12孔板中将GeneArt ® Precision TAL 和靶向AAVS1安全港基因座的CRISPR 核酸酶导入U2OS 和HepG2细胞系。
收集细胞裂解物并进行处理，确定剪切效率。
使用Lipofectamine ® 3000转染，两种细胞系中TALEN 和CRISPR 介导的剪切效率均有提升。
(A)使用Lipofectamine ® 3000转染U2OS 细胞，TALEN 剪切效率提高1.5倍，CRISPR 剪切稍有提高。
(B) HepG2细胞的TALEN 和CRISPR 介导的剪切效率分别提高3倍和8倍。
细胞类型Lipofectamine® 3000试剂转染效率蛋白表达提升倍数，Lipofectamine® 3000与2000试剂相比3T34 4T12 A4312 A5493 ACHN2 bEnd.39 BJ3 BT-5494 C2C123 C65 Caco-22 Caki-14 CHO-K11 CHO-S1 COLO 2054 COS-74 DU 1452 H4603 H9c23 HCC19375 HCT1161 HEK 2932 HeLa3 Hep-3B2 Hepa 1-61 HepG29 Hs 578T3 cHT291 Huh-74 Jurkat1 K-5621细胞类型Lipofectamine® 3000试剂转染效率蛋白表达提升倍数，Lipofectamine® 3000与2000试剂相比L68L9292LNCaP6MCF 10A5MCF72MDA-MB-2313MDA-MB-4351MDA-MB-4689MDCK1Neuro-2a1NCI-H232NCI-H46017P191PANC-13PC122RAW264.74RBL-2H32RD4Saos-24SH-SY5Y1SK-BR-34SK-MEL-282SK-N-SH6SK-OV-33SW4802SW6205T98G4U2OS3U9372Vero1转染效率仅供研究使用。
不得用于诊断。
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