基因转移技术
什么是基因转移技术？
基因转移技术是将特定的外源基因信息转入到受体细胞或生物并使其表达的一种基因工程技术。

基因转移技术已广泛用于基因的结构和功能分析、基因表达与调控、基因治疗与转基因动物模型建立等研究方向。

基因转移方法有哪几类？
一、化学转染
1.磷酸钙法
该技术通过将磷酸盐溶液和含有DNA的氯化钙溶液进行缓慢混合，形成DNA-磷酸钙共沉淀复合物。

复合物能粘附于细胞膜上，通过细胞内吞作用进入细胞浆中。

优点：实验室中转染哺乳动物细胞最广泛使用的方法。

试剂易获得，成本低，可用于瞬时转染和稳定转染。

缺点：重复性差，转染效率低。

对基因和细胞的选择要求较高。

2.DEAE-葡聚糖法
DEAE-葡聚糖是最早开发的转染试剂之一。

它是一种可溶的聚阳离子碳水化合物，通过与带负电的DNA结合形成聚集物。

携带正电荷的复合物与带负电荷的细胞膜结合，通过细胞内吞作用进入细胞中。

与磷酸钙转染过程中形成的复合物颗粒相比，其粒径更小。

优点：该试剂价格便宜，并且过程简便、效率较高。

一般常用于瞬时转染，DNA使用量较少。

缺点：不适用于稳定转染。

3.脂质体法
脂质体分为单层脂质体和多层脂质体。

常用的阳离子脂质体与带负电的DNA结合，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，通过细胞内吞作用进入细胞。

脂质体介导的基因转移的效率可以通过整合病毒蛋白来提高，从而促进病毒包膜和细胞膜之间的主动融合。

这种融合粒子被称为病毒体。

优点：能够在活体内应用，毒性低、重复性好。

适用性广，在很多细胞中能得到有效的瞬时转染和稳定转染效果。

缺点：试剂难以自制，商品较为昂贵，转染效果在不同细胞类型中差异较大。

二、物理转染
1.电穿孔法
电穿孔法是将细胞暴露在短暂的高场强脉冲电场中，通过在细胞膜上打孔而将核酸导入进行细胞的方法。

脉冲的大小和持续时间决定了转染效率，对于不同的细胞系，必须经过优化验证来确定电转条件。

优点：高效，高重复性，适用性广，质粒和基因组片段均可用此方法导入细胞或体内。

缺点：需要昂贵的仪器，使用的细胞数量较大，DNA浓度较高，由此也导致细胞致死率较高。

2.显微注射法
此方法是在显微镜下将微量的核酸注射到细胞的细胞质或细胞核中，从而实现核酸的导入。

该技术最重要的用途是将核酸引入卵母细胞，卵细胞和动物胚胎中，可用于基因瞬时表达分析（例如在鱼类或非洲爪蟾中）或制备转基因动物（例如小鼠，果蝇）。

优点：可瞬时和稳定转染，对细胞类型和状态的依赖性较低。

可实现核酸的直接核传递，避免了内源性途径，可确保核酸完整传递。

缺点：操作设备昂贵。

操作耗时，转染细胞数有限。

3.基因枪粒子轰击法
粒子轰击法是将核酸包被于微米大小的金或钨微粒上，然后通过气体冲击波加速粒子进入细胞或组织。

这种方法的一个主要优点是可以将核酸传递到组织切片的深层细胞中，并且可以通过改变施加压力来调节穿透的深度。

粒子的大小和总质量以及轰击力是平衡有效穿透和细胞损伤的重要参数。

优点：可用于人的表皮细胞、纤维细胞、淋巴细胞系以及原代细胞。

无需对细胞进行处理。

实验过程相对容易控制，重复性高。

缺点：操作设备昂贵，细胞死亡率较高。

三、病毒转导法
以病毒为载体，将外源目的基因通过基因重组技术组装于病毒上，用其去感染受体细胞。

病毒载体因其特异的组成结构通常可以高效地进入特定类型的细胞中。

病毒类型主要为包膜和无包膜病毒，两者与细胞膜的相互作用方式有所差异。

包膜病毒的侵入主要是病毒包膜和宿主细胞膜融合的过程。

而无包膜病毒则通过特定的病毒蛋白介导进入被感染细胞内。

病毒介导的转染
称之为转导，病毒转导方法相对于裸质粒DNA转染来说有更高的导入效率。

常用于难转染和原代细胞的瞬时或稳定表达细胞株的制备。

其中以慢病毒、逆转录病毒、腺病毒及腺相关病毒等最为常用。

1.慢病毒
慢病毒载体系统是一种能非常高效的把外源基因稳定整合到哺乳动物细胞中的载体工具。

除了常规质粒转染外，目前该系统也是把外源基因转入哺乳动物细胞的最常用方法之一。

由于具有目的基因和启动子选择的灵活性以及转染细胞类型的广泛性两大特点，使其成为应用范围较广的外源基因表达系统。

慢病毒载体来源于人类免疫缺陷病毒HIV，属于逆转录病毒家族。

野生型慢病毒基因组是线性双正链RNA。

而目前通过改造优化，慢病毒载体删除了与病毒包装和转导相关的基因（这些基因由辅助质粒进行表达，用于病毒包装过程），使产生的慢病毒颗粒是复制缺陷型的。

即包装的病毒只具有转导靶细胞的能力，而无法在靶细胞中进行大量复制，因而具有很高的生物安全性。

当病毒转导靶细胞时，释放到宿主细胞中的病毒RNA借助逆转录酶逆转录成双链DNA，然后随机整合进宿主细胞的基因组中。

在病毒载体中，位于两个LTR的DNA片段和病毒基因组都会稳定整合到靶细胞的基因组中。

2.MMLV逆转录病毒
MMLV逆转录病毒载体来源于莫洛尼（氏）鼠白血病病毒，属于逆转录病毒家族，野生型逆转录病毒基因组是线性双正链RNA。

当病毒感染细胞后，其基因组在胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为DNA，形成DNA 整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。

它能高效的将目的基因（或RNAi）导入动物和人的原代细胞或细胞系。

整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白，或产生RNAi干扰。

和慢病毒不同的是，MMLV只能感染分裂细胞而对非分裂细胞没有感染能力。

3.腺病毒
腺病毒载体是应用较为广泛的病毒载体系统。

腺病毒对大多数细胞都有很高的感染效率，包括分裂和不分裂细胞及原代细胞，除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因。

当腺病毒转导宿主细胞时，两个ITR之间的外源DNA及病毒基因组一起进入细胞，并以游离DNA的形式存在于细胞核中。

由于腺病毒基因组不整合到宿主的基因组，所以腺病毒在宿主体内是瞬时表达。

腺病毒可以直接感染动物个体，通常用于疫苗和基因治疗，腺病毒载体的应用面临的主要问题是反复使用容易引起宿主的免疫排斥反应。

4.腺相关病毒
腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus，AAV)是一类无包膜的单链线状DNA病毒,其基因组DNA约4.7 kb。

具有安全性高、免疫原性低、宿主范围广、表达稳定等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一。

当病毒转导宿主细胞时，两个ITR之间的外源DNA及病毒基因组一起进入细胞，线性双链DNA基因组以游离DNA的形式存在于细胞核中。

其具有多种血清型，各种不同血清型的AAV载体的主要区别是衣壳蛋白不同，因此对不同的组织和细胞的转染效率存在差异。

综合各病毒载体的特性，病毒载体较其他非病毒载体体系的优缺点主要为
优点：高转导效率、适用于较难转染的细胞（如原代细胞、干细胞等）、体内体外适用性广泛、可构建稳定或瞬时表达细胞株。

缺点：基因插入大小受限、病毒包装技术较为复杂、存在一定的生物安全考虑问题。