常用翻译系统有以下几种：
1. 兔网织细胞裂解物(reticylocyte lysate system)
由未成熟的兔红细胞裂解而成，该种细胞是向动物注射苯 肼后引起贫血产生的,向该系统加入血红素基和能量物质，裂解 物中的内源mRNA可被翻译成球蛋白 ，其合成速度与用完整细 胞的合成速度接近。
微球菌核酸酶可除去内源mRNA，同时也不会对系统中的tRNA 和rRNA 损伤过大。由于该核酸酶的活性依赖于Ca2+，当除去内 源mRNA后，可用EGTA除去Ca2+，此系统仍可保持70%的活性。
A A' C' 退火
B C
A' A PolI B dNTP
C' C
A' A B
C' C
转化大肠杆菌
突变体
A' A C'C
A' A
B' B C'
C
低聚核苷酸缺失
低 插入突变
聚 核
A A' B’C' 退火 C
苷
酸
插
入
A' A PolI
B' C'
C
dNTP
A' A
B' C' C
转化大肠杆菌
A' A C' C
基因组序列分析 SNP序列分析 PCR引物设计、DNA杂交探针设计 载体图形绘制
第二节
网络技术 在基因工程中的应用
RE1 （1）RE1
（2）S1
T4DNA连接酶
结构: (1) 5'-和3'-突起
RE1
端;(2)第一种限制酶 切, 脱磷酸化或α-磷
Exo + S1
T4DNA连接酶
酸硫代物dNTP补齐
末端,第二种限制酶切, 然后λ外切酶或ExoIII 作用.
单向缺失
A B
RE
C D
EtBr+RE
AB
+ 35’’外切酶 S1
5. 密码子的使用频率（选用适当宿主细胞）
6. 翻译产物的后修饰 选用适当宿主细胞
7. 翻译产物的稳定性
8. 外源基因产物对宿主是否有害
9. 外源基因产物产量（选用不同拷贝数的载体）
10. 外源基因的最终产物是否具有生物活性（选用适 当宿主细胞）
11. 外源基因的稳定性（改变宿主细胞遗传特性， 如将外源基因插入染色体）
2. 遗传互补检测
如用于酵母菌的各种氨基酸, 核苷酸合成酶基因: LEU2, TRP1, TRP3, URA3等
3. 表型选择
如用于细菌, 植物和动物的LacZ, GUS等基因; 用于细菌 的噬菌斑
4. 凝胶电泳
对于自主复制型载体, 可从转化子中提取质粒DNA, 然后 经过电泳法进一步证实
5. Southern杂交
3)将上述配对的突变体用含10个核苷酸的人工接头连接起来.
*人工接头的插入并未改变原来DNA片段的核苷酸数目.如果出 现表型的变化则是由人工接头的核苷酸改变(即点突变)造成的.
4. 易错PCR方法
5. DNA片段洗牌技术
RE1
RE2
RE2
RE1
RE1
RE2
ExoIII或S1
Exo 或 S1
1 2 3 4
质的分泌等。
一．转录系统
1. 体外转录系统
1）分离RNA聚合酶，然后在体外进行待测DNA的转录反应 2）利用全细胞抽提液，加入外源DNA，目前使用最广泛的 抽提液来自海拉细胞和KB细胞 3）利用具有SP6, T3和T7启动子的载体转录插入的外源DNA
2. 体内转录系统 先分离细胞核，再进行转录反应
3. 其它系统：
鼠骨髓瘤抽提物，艾氏腹水瘤和酿酒酵母裂解物等。
4. 两栖动物卵母细胞: 翻译效率高，翻译产物稳定，灵敏
度高（10ng mRNA ），也可作为转录—翻译系统。
三．转录—翻译系统
1. 原核生物系统
1) 体内基因表达系统
i. UV照射宿主系统(U.V.—irradiated host system)
(pBR322探针)
LEU2 leu2 URA3
二次 同源重组
Ura-Leu+
同源重组
LEU2
URA3 leu2 LEU2
URA3 leu2
Ura+Leu+
URA3
+LEU2
leu2
Ura-Leu-
RE1
RE1
RE2
+RE2
T4 DNA
LEU2
URA3 Ligase
URA3 RE1
RE2
Ura-Leu+ LEU2
2. 低聚核苷酸定向突变
A:
退火
PolI dNTP
转化大肠杆菌
I
II
B:
T4 DNA
+
Ligase
C:
RE RE
T4 DNA Polபைடு நூலகம்
T4 DNA ligase
Pol IK
转化大肠杆菌
I
II
3. 人工接头扫描法
1)利用ExoIII/S1从DNA两端进行顺序缺失,获一系列5'-和3'-端 缺失体
2)从两个系列的缺失体中选出适当配对的缺失体,使两者连接起 来以后相差10个核苷酸.
1' 2' 3' 4'
N
3’—缺失
分组连接 +人工接头
n'
5’—缺失
第二节
基因置换
体外突变的基因引入原生质体内,检查不同的突变对表型有何影响, 因此就需要用突变基因将野生型基因置换出来(原理见"载体"一 章).
筛选方法: 突变基因DNA分子(leu2, URA3) 转化 S.cerevisia(Ura-) Ura+转化体 选择Ura-重组体 影印筛选leu-突 变体 核酸杂交
12. 对于制备大量外源基因产物，还须考虑到表达 产物与其它细胞成分的分离方法
二. 表达系统
1. 大肠杆菌系统: 融合表达和直接表达
小于80AAs的多肽可用融合表达系统, 分子量在100300AAs 且无过多半胱氨酸的多肽可用直接表达
pET(plasmid for expression by T7 RNA polymerase), pTrcHis系列载体
二．翻译系统
体外翻译系统（In vitro translation system）又称之为体外蛋白 质合成系统(in vitro protein synthesis system)，是一种细胞裂解 物，这种系统只有翻译功能，当加入外源mRNA，能量物质和 氨基酸，该系统就能合成蛋白质，经SDS—PAGE后可检测出 翻译活性。
2. 酵母表达系统: 酿酒酵母和巴氏毕赤酵母
(Pichia pastoris)系统
直接表达和分泌表达
3. 昆虫杆状病毒表达系统
直接表达和分泌表达
4. 哺乳动物细胞表达系统
瞬时表达和稳定表达: 非微生物来源的大于500AAs的 分泌蛋白质和表面受体蛋白
第八章
基因突变
第一节
基因的体外定向突变
一.缺失突变
第六章
基因的转移技术
第一节
基因的导入方法
所谓基因的转移技术就是将外源目的基因或
DNA片段引人受体生物或细胞并检查其在转化细 胞中表达结果的一种技术。
一．基因导入方法
1．细胞融合
<10-6
2．微细胞介导的基因转移
小于或等于10-6
3．染色体介导的基因转移
<10-6利用中期染色体
DNA进行转移
4．脂质体介导的基因转移
A' A
B' B
C' C
二. 插入突变
在已知的位点处插入一段DNA,其方法与缺失突变体十 分相似,只是反其道行之
三. 点突变
1. 区域随机突变
RE (1)RE酶切
诱变
与大片段
RE
RE (2)分离片段
亚硝酸
连接
RE
羟胺
甲氧胺
RE RE+EtBr
或 DNaseI
外切酶
核P苷o诱l酸IN变a类H似SCO物3 T
iii.大细胞系统(maxicell system)
对紫外光敏感的E.coli突变株经低剂量紫外光照射后，损伤的 DNA会被大量降解，由于质粒DNA分子量小，可继续存活。加 入标记氨基酸后，质粒上的外源基因可获带标记产物，用 SDS—PAGE分析。
2) 体外基因表达系
E.coli无细胞粗提液，加入外源DNA和必须因子后可得表达 产物。
A:
1. 限制酶片段缺失
B:
1
RE1
(1) RE1
2
3 RE1 (2)T4DNA连接酶
1 3 RE1
1 2
(1) RE1 (2)Bal31
1
3 RE1 (3)T4DNA连接酶
4
4
C: RE1
RE2
RE1 RE1
12 3 4
65
RE2
随机断裂 RE1
5 6 1 23 4
RE1 RE2
RE1
3 456
12
C D
A
A B
或
A
A
C或
B
DC
3' 5'
D
5' 3'
D
D
RE1 RE2
5' 3'
RE2
RE1
3' 5'
5' 3'
RE2
RE2
5'